蛹虫草菌丝体粗多糖提取方法初探

蛹虫草菌丝体粗多糖提取方法初探 第39卷第1期 2008年1月 东北农业大学学报 JournalofNortheastAgriculturalUniversity 39fl1:58~61 Jan.2008 文章编号1005—9369(2008)01—0058—04 蛹虫草菌丝体粗多糖提取方法初探 刘华晶,许修宏p,马怀良,黄芳,腾培文 (1.东北农业大学资源与环境学院,哈尔滨150030:2.牡丹江师范学院生物系,黑龙江牡丹江 157012 3.武汉生物工程学院生物工程系,武汉430415) 摘要:试验从蛹虫草菌丝体中提取多糖,用水和碱溶液两种溶剂分别进行提取实验,进行正 交旋转试验设 计,利用正交旋转设计软件包计算从而找到多糖最佳提取条件. 关键词:蛹虫草;多糖;提取 中图分类号:S182;Q539文献标识码:A 食用菌多糖在国际上被称为”生物应答效应 物”(BiologicalResponseModifier,BRM),它对肿瘤 的生长具有一定的抑制作用,能够恢复和提高人 体免疫活性ll1.多糖(Polysaccharide)是存在于自然 界的醛糖和酮糖通过糖苷键连在一起的多聚物, 是一切有生命的有机体必不可少的成分,同维持 生物机能密切相关.多糖是自然界中分子结构复 杂,数量庞大的糖类,普遍存在于动物,植物和 微生物中,特别是在高等植物,动物,微生物, 地衣和海藻中含量丰富. 蛹虫草(Cordycepsmilitaris)是生长在蛹体上的 一 种真菌,经鉴定为子囊菌亚门(Ascomyeotina), 麦角菌科(Clariceptaceae),虫草属(Cordyceps)植 物.国内外学者对其化学成分,生理活性进行了 较系统的研究,多糖是蛹虫草的重要组成成分 之一.蛹虫草多糖的生物活性与提取方法有关. 一 般是按照多糖的特性用水或稀盐,稀碱,稀酸 提取,提取液浓缩后,加甲醇,乙醇或丙酮等沉 淀析出.提取方法不同得到的多糖结构不同,其 生物活性也不同l5l.本文采用液体发酵方法研究蛹 虫草胞内多糖的最佳提取工艺,摸索多糖最佳提 取条件. 收稿日期:2006—04一l3 基金项目:黑龙江省科技 计划 项目进度计划表范例计划下载计划下载计划下载课程教学计划下载 项目(KT05A400—1);哈尔滨市科 技攻关计划项目(2007AA6CN105);东北农业大学创新团队发展计划 项目(CXT003—2—1);黑龙江省教育厅科学技术研究重大项目(10511Z 006) 作者简介:刘华晶(1979一),女,黑龙江人,博士研究生,助 教,主要从事农业微生物方面的研究工作. 通讯作者E—mail:howard2857@hotmail.com 1材料与方法 1.1供试菌种 蛹虫草为东北农业大学资源与环境学院农业微 生物教研室保藏菌种. 1.2仪器,设备 超净工作台,摇床,真空抽气泵,真空干燥 器,旋转蒸发仪等. 1.3液体发酵培养基 培养基配方为:蔗糖20g,玉米粉5g,蛋白 胨4g,KH2PO45g,MgSO43g,VBI微量. 1.4摇床发酵试验 按照常规方法制作液体培养基,在无菌条件下 接人蛹虫草菌种,置于往复式摇床上培养,温度为 25,27oC,100,110r?min,,发酵培养5d,待菌丝 小球长至3mm左右即可. 1.5旋转正交试验设计 试验过程中菌丝小球为发酵液过滤后离心所 得,湿重为20g?瓶(干重为湿重的10%),采用 水,NaOH水溶液介质进行提取(以下简称水提, 碱提),具体试验因素设计见 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 】,2. 1.6工艺 流程 快递问题件怎么处理流程河南自建厂房流程下载关于规范招聘需求审批流程制作流程表下载邮件下载流程设计 蛹虫草菌丝体粗多糖提取工艺流程为:摇床 液体发酵培养蛹虫草菌丝体(100,110r?min)一菌 丝体离心(4000r?min)一高效组织捣碎机捣碎 (15000r?min)一水(碱)提取一离心去除沉淀一滤 液浓缩至原体积的1/5一加3倍体积乙醇进行沉 淀一Sevag法除蛋白一粗多糖. 第1期刘华晶等:蛹虫草菌丝体粗多糖提取方法初探 表1水分提取因素水平编码 Table1Factorlevelcodeforpurewaterextraction 2结果与分析 2.1粗多糖产量测定 不同方法所得粗多糖产量见图1. 2.2利用正交旋转设计软件包进行分析得到多糖 产量最优模型 2.2.1水提多糖 F=F(一1.68,1.68,一1.68)=一0.07 品 0.7 0.1 0 表2NaOH提取因素水平编码表 Table2Factorlevelcodeforalkalineextraction F眦,=F(0.23,一0.15,一0.1)=0.27 得到回归方程为: F(x)--0.267+0.O13xl一0.O05x2+0.O02x3—0.032xl一 0.O03xl2—0.O19xl3—0.023x22+0.O13x2x3—0.023x3z 由模型可以求出水提多糖最优条件为温度水平 为0.23,即91.38,时间水平为一0.15,即1.9lh; 液料比为一0.1水平,即11.7倍的液料比.20g过 滤后的湿菌丝可以得到最大多糖提取量0.27g. 口碱提粗多糖Alkalineextraction囫水提粗多糖Purewaterextraction 12345678910l1121314151617181920212223 正交设计组分 Factorsoforthogona]design 图1碱提和水提对粗多糖产量的影响 Fig.1Effectofalkalineextractionandpurewaterextractiononweightofrawpolysacharrides 2.2.2用正交旋转回归软件包分析水提试验各种因 素交互作用对多糖得率的影响 在模型中将温度同定在1,0,一1水平上,得 到时问和液料比影响的交互作用:多糖得率在1, 0,一1水平时,提取时间和液料比的值在中等水平 时得率较高,而在温度为1水平时,最低得率出现 在时间较低,液料比较高的条件,由于在时问水平 上的等值线密度大于液料比,说明时间的效应大于 液料比对多糖得率的影响;温度为0水平时最低得 率出现在时间较高,液料比较低的条件,『=扫于等值 线密度相同,说明二者对多糖得率的效应相同;温 度为一1水平时最低得率出现在时间较高,液料比 较低的条件,由于等值线密度相同,说明二者对多 糖得率的效应相同. 在模型中将时间固定在1,0,一1水平上,得到 温度和液料比影响的交互作用:在时间为1,0,一1 n========= 助翻翰翻 翻翰 东北农业大学学报第39卷 j个水平时,多糖得率均在温度,液料比处于中 等水平时最高,二者对多糖得率的影响效应均比 较大. 在模型中将液料比固定在1,0,一1水平上, 得到温度和时间影响交互作用:在时问为1,0水 平时,多糖得率均在温度,时间处于中等水平时最 高,二者对多糖得率的影响效应均比较大.在液料 比为一1水平时最低值出现在温度较低而时间较高 的水平,由于温度的等值线密度大于时间,说明温 度的影响效应较大. 2.2_3碱提多糖 F…=F(一1.68,1.21,1.68)=一0.27 FF(一1.56,1.68,一1.68)=0.79 得到回归方程为: F(x)=5.442+0.056xl+0.53lx2+1.025x3+0.888X12+ 0.215xl2+1.361xl3+1.27222+1.322x~3+0.727x32 由模型可以求出碱提多糖最优条件是温度水平 为一1.56,即76?,时问水平为1.68,即4h,碱 浓度为一1.68水平,即NaOH浓度为0.4%,20g过 滤后的湿菌丝可以得到最大多糖提取量0.79g. 2-2.4用正交旋转回归软件包分析碱提试验各种因 素交互作用对多糖得率的影响 在模型中将温度固定在1,0,一1水平上,得 到时间和碱浓度影响的交互作用:在温度为1水平 时,最高得率出现在时间较高而碱浓度较低的水 平,最低得率出现在时间较低而碱浓度较低的水 平,由于在时间方向的等值线密度较大,时问的影 响效应大;在温度为0水平时,最大值出现在时问 较大,碱浓度较低的水平,最小值出现在时问较 大,碱浓度较大的水平,碱浓度的影响效应大;在 温度为一1水平时,最大值出现在时间较大,碱浓 度较小的区域,最小值出现在时问较大,碱浓度较 高的区域,碱浓度影响效应较大. 在模型中将时间固定在1,0,一1水平上,得 到温度和碱浓度影响的交互作用:在时问为1,0 水平时,最大值出现在温度低,碱浓度也低的区 域,最小值出现在温度高而碱浓度低的区域,温度 的影响效应较大;在时间为一1水平时,最大值出 现在温度和碱浓度均较高的区域,最低值出现在温 度高,碱浓度低的区域,碱浓度影响效应较大. 在模型中将碱浓度同定在1,0,一1水平上, 得到温度和时问影响的交互作用:碱浓度为1水平 时,最大值出现在温度较高,时问较低的区域,最 小值出现在温度较低,时间较高的区域,二者影响 效应基本相同;碱浓度为0水平时,最大值出现在 温度中等,时间较高的区域,最小值出现在温度较 高,时间中等的区域,时间影响效应稍大;碱浓度 为一1水平时,最大值出现在温度较低,时间较高 的区域,最小值出现在温度较高,时间较低的区 域,时问影响效应稍大. 3结论 a.本实验水提和碱提分别设23个组分,碱提 的多糖得率有18个组分超过水提,可见用碱溶液 进行提取对于提高多糖得率有显着效果. b.碱提法最佳工艺流程:菌丝体离心(4000 r?min)一高效组织捣碎机捣碎(15000r?min)一 碱溶液提取一离心去除沉淀一滤液浓缩一加乙醇进 行沉淀--+Sevag法除蛋白一粗多糖. c.利用正交旋转设计软件经计算机模拟求解, 得到多糖提取的最优组合条件:水提多糖最优条件 为温度91.38?,时间1.91h,液料比为11.7倍, 20g过滤后的湿菌丝可以得到最大多糖提取量 0.27g;碱提多糖最优条件为温度76?,时问4h, NaOH浓度为0.4%,20g过滤后的湿菌丝可以得 到最大多糖提取量0.79g. [参考文献] [1]曹培让,吴祖道.金针菇子实体多糖PA5DE的提取及性质研 究[JI_生物化学杂志,1990,6(2):176. [2]FengXZ,BaoTT.Cordycepssinensis[M]//InstitureofMeat- eriaMedica,ChineseAcademyofMedicalSciences.Modernre- searchonChineseherbaldrugs.BeijingChineseAcademyof MedicalSciencesandPekingUnionMedicalCollegeJointPress, l995:90,1l3. [3】KadotaS,ShimaT,KikuchiT.Steroidalcomponetof”I—Tiara- Hong”andcordycepssinensis.Separationandidentificationby high-performanceliquidchromatograph[J].YakugakuZasshi,1986, 106(12):1092-1097. [4】贡成良,徐永智,杨昆,等.家蚕蛹虫草的毒性研究中国食 用菌,2004,22(61:54—56. [5]陈全斌,陈海燕,义祥辉,等.HPLC法测定罗汉果多糖相对分 子质量[J1_中草药,2003,34(12):1075—1076. 第l朗刘华晶等:蛹虫草菌丝体粗多糖提取方法初探6】. Preliminarystudyonmethodsforextractingraw p0lysaccharidesfrommyceliumof ,.z LIUHuajing,XUXiuhong,MAHuailiang,HUANGFang.TENGPeiwen1 (1.HesourcesandEnvironmentalSciencesCollege,NortheastAgriculturalUniversityHarbin150030.China 2DepartmentofBiology,MudanjiangTeachersCollege,MudanjiangHeilongjiang157012,China; 3?DepartmentofBioengineering,BioengineeringInstitute, Wuhan430415,China) Abstract:PolysaccharideswereextractedfrommyceliumofCordycepsmilitarisbypurewaterandalkaline water?Orthogonalregressiondesignwasadoptedandsoftwarepackagefororthogonalregressiondesignwasusedt0 obtaintheoptimumconditionfortheextraction. Keywords:Cordycepsmilitaris;polysaccharides;extraction