土大黄化学成分的提取与分离

土大黄化学成分的提取与分离 1.1实验仪器、试剂与材料 1.1.1仪器 JASCODIP–370型数字式旋光仪;Bio–Rad FTS–135型红外光谱仪 (KBr压片);UV210A型紫外可见光分度计;VG AUTO Spec–3000及Finnigan MAT 90质谱仪;Bruker AM–400、Bruker Av600及DRX–500核磁共振仪,TMS作为内标,δ为ppm,J为Hz;HPLC为Agilent 1100型高效液相色谱仪;ZORBAX SB–C18 (9.4×250 mm,i.d.) 半制备柱色谱柱,Agilent公司提供;AS–3120超声波清洗仪，天津奥特赛恩斯仪器有限公司，;BS110S电子天平，德国赛多利斯股份公司，;BSZ–100自动部分收集器(上海青浦泸西仪器厂)。 1.1.2试剂与材料 层析用硅胶(200–300目),青岛海洋化工厂生产;GF自制薄254层板;RP–18为40–60 ,m,Merk公司生产;MCI–gel CHP–20P;Sephadex LH–20 (40–70μm),瑞典Amersham Pharmacia Biotech AB公司生产。石油醚、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、甲醇均为工业级,经重蒸后使用。显色剂为碘蒸汽和10% HSO乙醇溶液。 24 1 1.1.3材料与来源 土大黄采自甘肃省,经湖北中医药大学中药鉴定教研室周小江副教授鉴定为蓼科，Polygonaceae，酸模属，Rumex，植物土大黄， Rumex patientia L.，的干燥根。 1.2实验内容 1.2.1土大黄的提取浓缩 将20kg土大黄去泥沙后粉碎成粗颗粒,6倍量95%乙醇,冷浸提取3次,每次24小时,期间经常进行搅拌,使其浸出量完全,合并提取液,减压浓缩至无醇味并回收溶剂。经反复多次的提取浓缩,最后得浓缩浸膏约2kg。 1.2.2土大黄总提取物的萃取 取土大黄浓缩物加适量的水使悬浮,依次分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇采用少量多次的斱法萃取,合并有机层溶媒,回收有机溶媒得到浸膏,备用。其中石油醚提取物41g,乙酸乙酯提取物约260g,正丁醇提取物700g。提取和萃取 流程 快递问题件怎么处理流程河南自建厂房流程下载关于规范招聘需求审批流程制作流程表下载邮件下载流程设计 图见Fig.1: 蒙酸模，巴天酸模， 95%乙醇冷浸三次,过滤,减压 回收溶剂至无醇味,用水混悬,萃取 石油醚部分 乙酸乙酯部分 正丁醇部分 水液部分 2 41g 700g 260g Fig.1 土大黄提取和萃取 流程图 破产流程图 免费下载数据库流程图下载数据库流程图下载研究框架流程图下载流程图下载word 1.2.3乙酸乙酯部位的分离与纯化 乙酸乙酯部分共260g,用300g硅胶拌样,1.5Kg硅胶装柱,按照CHCl:MeOH=100:1,98:2,96:4,92:8,9:1,4:1,2:1,1:1的梯度洗脱,将洗脱3 下来的样品分别浓缩,薄层展开,将薄层板上相似点的样品分别合并,得到总共6段。分别对其中四段用Silicagel、MCI Gel CHP–20、Sephadex LH–20等进行柱层析,同时结合制备薄层及高效液相进行分离纯化,得到单体化合物。乙酸乙酯提取物的分离流程图见Fig.2: 乙酸乙酯部位 硅胶柱层析(200-300)目,1.5 Kg CHCl:MeOH=100:1,98:2,96:4, 3 Fr.1 (4.3g) Fr.2 (39g) Fr.3 (12g) Fr.4 (29g) Fr.5(14g) Fr.6 (30g) 92:8,9:1,4:1,2:1,1:1梯度洗 MCI CHP20 MCI CHP20 MCI CHP20 MCI CHP20 SephaSephaSephaSephadex 脱 dex LH-20 dex LH-20 dex LH-20 LH-20 RP-18 RP-18 RP-18 RP-18 PTLC PTLC PTLC PTLC HPLC HPLC HPLC HPLC PTLC 4,8,14 2,3,9,15 5,11,12 1,6,7,10,13 Fig.2 土大黄乙酸乙酯部分的提取分离流程图 3 第二章 土大黄化学成分的结构鉴定 131C-NMR、DEPT的相关测化合物经纯度检测后,进行H-NMR、 试,若为已知化合物,结合相关文献确定化合物结构。若为新化合物,还须补充2DNMR、IR、OR、UV、ROESY及高分辨质谱的数据,通过对2DNMR数据进行归属确定新化合物结构。从中所分离得到土大黄的化合物的结构如下所示: (以上标注*者为新化合物) 4 2.1新化合物的结构鉴定 化合物01的结构鉴定: 化合物01结构 白色针状结晶,易溶于丙酮,10%硫酸乙醇浸泡后加热显淡黄绿 +-+-13色,ESI-MS:m/s249[M-H],499[2M-H]故分子量为250,通过C– ++ NMR、DEPT和 HR-ESI+MS确定分子式为CHO([M+Na]found 13145 273.0736, calcd. For CHNaO,250.0739), 计算其不饱和度Ω=7.UV13145 ,(logε)(MeOH):218nm,270nm,344nm.IR(KBr)cν:3368,2976,2932,19maxmax -1)1354,1861,1789,1636,1578,1452,1268,1163,1028,976(m.C–NMR和DEP T谱显示化合物有13个碳,其中2个甲基,5个次甲基,6个季碳。111H-NMR谱中芳香区信号有三个,偶合常数8.0 H结合H-HCOSY,Z 可知为苯环相邻的三个碳上的氢信号;高场区由积分可判断有两个甲 [9]基氢信号,通过汇总数据发现很类似文献,区别在于碳谱中只有一个羰基信号,氢谱m/z4.04多出了个dd峰,并结合二维谱推测C12位的羰基可能被还原成了羟基。相对构型斱面,通过ROESY谱图C1和C11和C12氢相关在同侧,但C12位羟基和甲基的相对位置待定。经文献检索未见该化合物的相关报道,推断其为一新化合物,命名为3-羟乙基-1,5-二羟基-4-羰基-2,3-环氧萘。其数据归属如表1: 5 表1 化合物01的NMR数据(400and100MHz,δin ppm,J in Hz,CDOD) 3 δC δH 编号 1 69.3 4.83(1H,s) 2 64.9 3 65.5 4 200.9 5 162.2 6 117.6 6.85(1H,d,J=8.0H) Z7 137.7 7.53(1H,t,J=8.0H) Z8 118.8 7.18(1H,d,J=8.0H) Z9 112.7 10 144.1 11 15.1 1.73(3H,s) 12 69.0 4.04(1H,dd,J=13.9,7.0H) Z13 20.1 1.52(3H,d,J=7.0H) Z 化合物01 COSY和HMBC相关 6 化合物01 ROESY相关 化合物02的结构鉴定: 化合物02结构 淡黄色固体,易溶于甲醇、丙酮,10%硫酸乙醇浸泡后加热显淡 - 黄绿色,ESI-MS:m/s 233[M-H], calcd 233.0813,故分子量为234。通 13过C–NMR、DEPT和 HR-ESI+MS可以确定其分子式CHO(m/z 13144 ,(logε) ,found 233.0816[M?H]),计算其不饱和度Ω =7。UV(MeOH):max266nm,231nm,205nm。IR(KBr)cν:3426,2924,2854,2353,1694,1628,1358,max -1131243,1169,1056,963(m)。C–NMR (100MHz)和DEPT谱显示13个碳,其中2个甲基, 2个亚甲基,2个次甲基,7个季碳,根据碳的个数和类别查阅相关文献可以推断它为一个萘类化合物,并且苯环上的只有一 11个氢未被取代。观察二维图谱,从H?H COSY上可以看到以下相关:H2-2和H-3、H-1相关。HMBC有以下主要相关: H?8和C-11/C-7/C- 7 9/C-1/C-6/C-10,H3-13和C-6/C-12/H2-2/C-1/C-3 /C-4,H2-3和C-2/C- 1110/C/4。综合以上H–HCOSY和HMBC信息可以确定化合物的平面结构。推断其为新化合物并且命名为6-羟乙基-1,5-二羟基-4-羰基-7-甲基萘。其数据归属如表2: 表2 化合物02的NMR数据(400and100MHz,δin ppm,J in Hz,Acetone) δC δH 编号 1 67.4 4.80(1H,dd, J=3.89,8.51H) Z 2 32.4 2.10(2H,m) 3 35.8 2.78(2H,m) 4 205.6 5 160.3 6 129.1 7 145.3 8 120.7 7.10(1H,d,J=8.0H) Z 9 149.6 10 114.1 11 20.2 2.28(3H,s) 12 203.1 8 13 32.0 2.52(3H,s) 化合物02 COSY和HMBC相关 化合物03的结构鉴定: 化合物03结构 黄色固体,易溶于甲醇、丙酮,10%硫酸乙醇浸泡后加热显黄绿色,比旋光度[α]20 D:-8.1 (c 0.21, MeOH), ESI-MS:m/s233[M- 13H],Calculated m/z(amu)233.0813, 故其分子量为234 ,通过C–NMR、DEPT和 HR-ESI+MS可以确定其分子式CHO(m/z found2313144 , (logε):267 , 3.0816[M?H]),计算其不饱和度Ω =7。 UV(MeOH)max,234,209nm.IR(KBr)cν:3432,2923,2854,2353,1629,1356,1271,1173,10max -1) 1356,548(m.C–NMR (100MHz)和DEPT谱显示13个碳,其中2个甲基, 2个亚甲基,2个次甲基,7个季碳,化合物03是1位羟基,化 9 合物02是2位羟基,这个可以从氢谱的不同解出化合物03的结构。 11从H?H COSY上可以看到以下相关:H2-3和H-2/H-1相关。从HMBC上可以看到以下主要相关: H?1和C-2/C-3/C-10/C-9/C-8,H2- 113和C-4/C-2/c-10,H3-13和C-6/C-12。综合以上H–HCOSY和HMBC信息可以确定化合物的平面结构。推断其为新化合物并且命名为6-羟乙基-2,5-二羟基-4-羰基-7-甲基萘。其数据归属如表3: 表3 化合物03的NMR数据(400and100MHz,δin ppm,J in Hz,Acetone) δC δH 编号 1 38.2 2.82(2H,m) 2 66.2 4.43(1H,m) 3 47.5 2.83(2H,m) 4 205.9 5 160.3 6 129.1 7 145.3 8 123.0 6.71(1H,s) 9 144.7 10 115.5 10 11 20.2 2.23(3H,s) 12 203.1 13 32.0 2.48(3H,s) 化合物03 COSY和HMBC相关 化合物04结构鉴定: 化合物04结构 白色针晶,易溶于甲醇,10%硫酸乙醇浸泡后加热先显淡黄绿色, -13 ESI-MS:m/s279[M-H]故分子量为280,通过C–NMR、DEPT和 +HR-ESI+MS确定分子式CHO([M+H]found279.0868), 计算其不饱14166 (logε),和度Ω =7。UV(MeOH):324nm,292nm,202nm.IR(KBr)cν:3maxmax -113444,2956.2923,1629,1452,1377,1160,1098,1025,858,769， m，。C–N MR和DEPT谱显示化合物有2个甲基,1个甲氧基,4个次甲基,7 13个季碳。从C–NMR谱中明显看出化合物04比化合物01多一个 11 -OCH3,在HMBC中可以很明显的看到-OCH3和C-7相关, H-11和 11C-1/C-2相关,H-13和C-3/C-12相关;从H?H COSY上可以看到H-13和H-12相关;通过ROESY谱图C1和C11和C12氢相关在同侧,但C12位羟基和甲基的相对位置待定。其他C的数据和化合物01基本相同,查阅文献并推断其为新化合物,命名为3-羟乙基-1,5-二羟基-4-羰基-7-甲氧基-2,3-环氧萘。具体数据如表4: 表4化合物04的NMR数据(400and100MHz,δin ppm,J in Hz,MeOD) δC δH 编号 1 70.0 4.78(1H,s) 2 66.1 3 66.4 4 199.7 5 166.1 6 100.9 6.38(1H,d,J=1.81H) Z 7 168.4 8 107.0 6.74(1H,s) 9 146.2 10 109.3 11 15.3 1.70(3H,s) 12 69.4 3.90(1H,m) 13 20.0 1.54.04(3H,d,J=6.87H) Z 12 14 56.2 3.84 (3H,s) 化合物04 COSY、HMBC、ROESY相关 化合物05结构解析: 化合物05结构 淡黄色固体,易溶于甲醇,10%硫酸乙醇浸泡后加热先显淡黄绿 +-13色, ESI-MS:m/s217[M-H]故分子量为218,通过C–NMR、DEP +T和 HR-ESI+MS确定分子式为CHO([M+H]found217.0864), 计13143 ,(logε)K算其不饱和度Ω =7。UV(MeOH):345nm,280nm,203nm.IR(max -Br:)ν3438,3431,3062,2924,1600,1454,1247,1203,1162,817,722 (mmax 113)。C–NMR和DEPT谱显示化合物有2个甲基,6个次甲基,5个季 13碳。从C–NMR谱中可以看出化合物05有苯环。观察二维图谱,从11H?H COSY上可以看到以下相关:H-6和H-7,H-1和H-2,H-2和H-11,H-12和H-13。从HMBC上可以看到以下主要相关: H?12和C-1 13 3/C-2/C-4,H3-11和C-2/C-1,H-8和C-7/C-9,H-6和C-8,H-1和C- 118/C-9相关。综合以上H–HCOSY和HMBC信息可以确定化合物的 平面结构。命名为1,7-二羟基-2-甲基-3-丙烯基-4-羰基萘。具体数据如 表5: 表5化合物05的NMR数据(400and100MHz,δin ppm,J in Hz,MeOD) δC δH 编号 1 73.7 4.53，1H,d, J=2.82H) Z2 38.3 3.35(1H,dd,J=2.88,7.35H) Z3 144.3 4 192.6 5 137.8 7.44(1H,d,J=1.01H) Z6 118.9 6.84(1H,d,J=4.19Hz) 7 164.6 8 121.8 6.83(1H,m) 9 116.4 10 138.9 11 13.9 1.88(3H,d, J=7.26Hz) 12 140.2 7.14(1H,q,J=7.27,7.27,7.26H) Z13 18.0 0.88(3H,d,J=7.28H) Z 14 化合物05 COSY和HMBC相关 2.2 已知化合物的结构鉴定 1化合物6:淡黄色针晶,分子式为CHO;H-NMR(MeOD,500MH19228 z):δ2.21(3H,s,H-1),2.50(3H,s,H-2),3.24(4H,m,H-2'),3.35(2H,m,H-3'),3.4H 5(2H,m,H-4'),3.67(1H,m,H-5'),3.96(1H,m,H-6'),5.02(1H,d,J = 7.73 Hz, H-1'),7.05(1H, s, H-4),7.24 (1H,d,J =1.51Hz,H-5),7.27(1H,t,J =7.70,7. 1370Hz,H-6);C-NMR(MeOD,125 MHz):δ20.08(q,C-11),32.61(q,C-13),C 62.67(t,C-6'),71.48(d,C-4'),75.18(d,C-5'),78.37(d,C-3'),79.04(d,C-2'),104.52(d,C-1'),112.06(d,C-7),115.13 (s,C-9),121.15(d,C-4),124.08(d,C-5),126.33(s,C-2),128.77(d, C-6),134.83(s,C-10),138.29(s,C-3),152.90(s,C-1),156. [10]37(s, C-8),208.47(s,C-12).以上数据不文献报道基本一致,故判定为 酸模素- 8- O-β- D-葡萄糖苷. 1淡黄色粉末,化合物7:分子式为CHO;H-NMR(MeOD,500MH21249 z):δ2.21(3H,s,H-1),2.23(3H,S)2.50(3H, s, H-2),3.24 (4H, m,H-2')3.35H (2H,m,H-3'),3.45(2H,m,H-4'),3.67(1H, m,H-5'),3.96(1H,m,H-6'),5.02(1H,d,J =7.73Hz,H-1'),7.05(1H,s,H-4),7.24(1H,d,J =1.51Hz,H-5),7.27(1H,t,J 13=7.70,7.70Hz,H-6);C-NMR( MeOD,125MHz ):Δ19.88(q,C-11),20.72C 15 (q,C-8'),32.40(q,C-13),64.57(t,C-6'),71.47(d,C-4'),74.88(d,C-5'),75.88(d,C-3'),77.93(d,C-2'),104.22(d,C-1'),112.01(d,C-7),115.02(s,C-9),120.97(d,C-4),124.10(d,C-5),126.19(s,C-2),128.38(d,C-6),134.68(s,C-10),138.07(s,C-3),152.72(s,C-1),155.97(s,C-8),172.61(CO-CH2),208.23(s,C-12).以上数 [11]Hastatuside B.据不文献报道基本一致故判定为 1淡黄色粉末化合物8:,分子式为 CHO;H-NMR(MeOH,500MH20249 z):δ2.58(3H,s,H-13),6.99(1H,m,H-5),6.79(1H,d,J =2Hz,H-7),3.75(1H,dd,H J=5.59,12.11Hz,H-2'),3.45(1H, m,H-3'),5.08(1H,d,J=7.59Hz,H-1'),3.53(1 13H,m,H-4'),3.94(1H,m,H-5');C-NMR(MeOH,125MHz):δ20.24(q,C-11),3C 2.58(q,C-13),55.96(q,C-14),62.39(t,C-6'),71.24(d,C-5'),74.91(d,C-3'),78.11(d,C-2'),78.79(d,C-4'),102.46(d,C-1'),104.25(d,C-5),104.41(d,C-7),110.30(s,C-9),120.33(d,C-4),123.93(s,C-2),135.46(s,C-10),139.14(s,C-3),153.7 [12]经不文献对照1(s,C-1),157.16(s,C-8),160.40(s,C-6), 208.17(s,C-12). 确定化合物为:8-O--D-Gluco-pyrAnos-yltorachrysone. β 1化合物9:黄色固体,分子式为CHO; H-NMR(Acetone, 500MH11123 z): δ 6.83(1H dd,J =8.05,29.92Hz,H-6),2.60(2H,dd, J =4.18,17.55Hz,H H-3),2.80(1H,m,H-2),7.54(1H, t,J =7.91,7.91 Hz,H-7), 7.04(1H, m,H- 138),4.79(1H,s, H-1),4.79(1H,s,H-1);C-NMR(Acetone,125MHz):δ70.83C (C-1),35.53(d,C-2),41.70(t,C-3),204.90(s,C-4),163.14(s,C-5),117.49(d,C-6),137.52(d,C-7),119.71(d,C-8),147.63(s,C-9),117.23(s,C-10),16.12(q,C-1 [13]1).经不文献对照确定此化合物为tranisoshinanolone. 1化合物10:黄色固体,分子式为CHO; H-NMR(CDCl,500MHz):111243 16 δ2.77(1H,d,J =17.18 Hz, H-2),6.82(1H,d,J =8.34Hz, H-5),4.87(5H,s,H H-4),2.91(1H,d,J =17.16 Hz, H-2),7.49(1H,t, J =7.96,7.96Hz,H-6),7.12 13(1Hd,J = 7.51 Hz, H-7),7.12(1H,d,J=7.51Hz,H-7);C-NMR(DMSO,12 5MHz):δ25.80(q,C-11),50.20(t,C-2),204.80(s,C-4),74.10(s,C-2),146.70(s,C C-10),137.70(d,C-6),162.40(s,C-5),119.70(d,C-8),117.50(d,C-6),116.40(s, [14]C-9),75.00(d,C-3),经不文献对照确定此化合物为5-Dihydroxy-2-met hyltetralone. 1化合物11:淡黄色固体,分子式为CHO; H-NMR(Acetone, 50015105 MHz): δ 2.73(3H, s, H-15), 6.60(1H, d, J =2.35Hz,H-2),7.05(1H,d,H 1J =2.08Hz,H-4),7.14(1H,d,J =2.34,Hz,H-5),7.14(1H,d,J =2.34,Hz,H-5); 3C-NMR(Acetone,125MHz):δ111.17(s,C-1),164.40(s,C-2),125.19(d,C-3),C 123.94(s,C-4),137.97(s,C-5),188.94(s,C-6),113.15(d,C-7),146.15(s,C-8),109.23(d,C-9),108.86(d,C-10),162.48(s,C-11),183.14(s,C-12),165.74(s,C-1 [15]3),135.38(s,C-14),23.90(q,C-15).经不文献对照确定此化合物为1,3,6- 三羟基-8-甲基蒽醌. 1化合物12:棕色固体,分子式为:CHO; H-NMR(Acetone, 500 13145 MHz):δ2.30(3H,s,H-13),7.09(1H,m,H-6), 6.68(1H,d,J =7.9Hz,H-7), H 5.99(1H,d,J =8.43Hz,H-5),5.55(1H,s,H-4),4.56(1H,d,J =8.28Hz,H-1),4.5 136(1H,d,J =8.28Hz,H-1);C-NMR(Acetone,125MHz):δ15.01(q,C-11),28.C 73(q,C-13),63.68(s,C-1),66.33(d,C-3),67.60(d,C-4),70.53(s,C-2),114.35(d,C-7),116.93(d,C-5),118.64(s,C-6),128.10(d,C-9),137.26(s,C-10),155.22(s, [16]C-8),205.87(s,C-12).经不文献对照确定此化合物3-Acetyl-2-methyl-1, 17 4,5-trihydroxy-2,3-epoxynaphthoquinol. 化合物13:黄色晶体,分子式为CHO; 1H-NMR(Acetone,500 13125 MHz):δH1.58(3H,s,H-11),2.39(3H,s,H-13),5.07(1H,d,J =9.03Hz,H-1),6.8 6(1H,d,J =8.32Hz,H-6),7.22(1H,d,J =7.54Hz,H-8),7.22(1H,d,J =7.54Hz, H-8);13C-NMR(Acetone,125MHz):δC15.76(q,C-11),29.21(q,C-13),65.86 (s,C-2),68.47(d,C-1),69.21(s,C-3),112.91(s,C-10),116.99(d,C-6),118.91(d,C-8),138.08(d,C-7),143.40(s,C-9),162.07(s,C-5),197.90(s,C-4),201.11(s,C [17]-12).经不文献对照确定此化合物为物3-acetyl-2-methyl-1,5-dihydrox y-2,3-epoxynaphthoquinol. 1化合物14:淡黄晶体,分子式为CHO; H-NMR(CDCl3,500MHz):11103 13δ6.59(H,s,H-8),5.95(1H,s,H-6),5.95(1H,s,H-6);C-NMR(CDCl3,125MHH z):δ165.80(s,C-2),117.50(d,C-3),180.90(s,C-4),143.20(s,C-5),111.30(d,CC -6),162.40(d,C-7),101.40(d,C-8),160.90(s,C-9),115.40(s,C-10),22.90(q,C- [18]11),19.60(q,C-12).经不文献对照确定此化合物为2,5-二甲基-7-羟基 色原酮. 1化合物15:棕色固体,分子式为CHO ;H-NMR(MeOH,500MHz 19225 )δ2.56(lH,m,H-9,2.79(2H,complex,H2-10),3.56(lH,dd,J=2.46,5.75Hz,H-lH 13l),3.76(3H,s,OMe),3.84(3H,s,OMe),6.21(lH,s,OH),6.62(lH,s,OH).C-NM R(MeOH,125MHz)δ37.7(t,C-1O),47.7(d,C-9),55.9(q,OMe)56.4(q,OMe),C 66.1(t,C-11),110.4(d,C-6),114.3(d,C-13),115.9(d,C-5),116.1(d,C-14),120.4(d,C-2),120.9(d,C-17)129.8(d,C-14),131.5(s,C-1),132.4(s,C-12),133.1(d,C [19]-7),145.6(s,C-15),147.0(s,C-4)148.6(s,C-3),149.0(s,C-16). 经不文献对 18 照确定此化合物(E)-5,5′-(3-(hydroxymethyl)but-1-ene-1,4-diyl)bis(2- methoxyphenol). 19