乳酸片球菌产谷氨酸脱羧酶的研究（可编辑）

乳酸片球菌产谷氨酸脱羧酶的研究（可编辑） 中文摘要 谷氨酸脱羧酶 ,是催化?谷氨酸上的羧 基进行脱羧反应的关键酶。分布广泛,在自然界的植物、动物和微生物中都 有它的存在。极可能作为特定的诊断酶预测和区分糖尿病,所以深入了解它 的结构和特性具有深刻的意义。催化生成的产物具有调节血压、促使 精神安定和促进脑部血液循环等重要的功效,所以目前人们也在致力于开发 富集 类的食品。 本文研究了从黑龙江大学发酵工程实验室保存的乳酸片球菌 .产生的,对其培养基、培养条件进行了优化,通过细胞破 葡聚糖凝胶 碎、硫酸铵盐析、 离子交换层析、 层析对进行了分离纯化,利用比色法测定酶活力,用.电泳法测定 其纯度。的纯化倍数为.,比活力达到./,回收率为.%。最 后研究了相关酶学性质。 结果表明,乳酸片球菌产的最佳发酵培养基配方为:谷氨酸的添加量 为/,葡萄糖 /,酵母提取物 /,蛋白胨. /,无水乙酸钠 /, . . . . ‘ ,,。 /, /,? .。 /,加蒸馏水定容,调至 最佳发酵条件:最佳接种量为%,菌体的最佳培养温度为?,最佳发酵时 ? 间为。 电泳后通过计算得到乳酸片球菌的相对分子质量为。 乳酸片球菌的酶学性质结果: 当底物广的浓度为/时,的活力达到最大。的浓度 为.%,最适温度为,最适为.,浓度为./时酶活 力最大。乳酸片球菌的米氏常数./,最大反应速度 ./。一 ?黑龙江大学硕士学位论文 关键词:谷氨酸脱羧酶;丫氨基丁酸:乳酸片球菌;分离纯化 ? ? ???????????薯????鼍???????????????萱????? ??????????????????????皇????一 . ,, . , ., , , . , . , ,., ,? . , .%. ., ./ ., ?/ ? ./, /, 扎 儿 。 ./,。 ./, ./,./,.., %. ?, . , , . %, /。 ? ? ?黑龙江大学硕士学位论文 , , ./ . ./,./. . : ; ;/ :? ? ?第章绪论??. .谷氨酸脱羧酶概述. 的来源??。 ..动物来源的的研究状况 ..植物来源的的研究状况??。 ..微生物来源的的研究状况. 活性的调节. 常用的分离纯化方法??。 . 常用的检测方法??. .. 比色法? ..氨基酸自动 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 仪法。 ..高效液相色谱法??.: . 的功能与应用 .本课题研究的目的和意义。 第章材料与方法?.. .实验材料? ..实验用菌株及保存方法..培养基 ..主要实验用试剂及配制方法 ..主要试验仪器 .试验方法. ..菌株活化、扩培、接种与发酵.. 比色法测定活性 ?黑龙江大学硕士学位论文 ..乳酸片球菌产培养基及发酵条件的优化? ..乳酸片球菌的分离纯化..乳酸片球菌酶学性质的研究 第章结果与分析.谷氨酸脱羧酶活力的测定. ..苯酚浓度对活力测定的影响. ..次氯酸钠溶液添加量对活力测定的影响? .. 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 曲线的绘制??. ..乳酸片球菌生长曲线的测定 .影响谷氨酸脱羧酶产量的因素? ..底物的添加量对产量的影响. ..培养基的主要成分及发酵条件对产量的影响. 的分离纯化 .. 离子交换层析纯化谷氨酸脱羧酶.. .葡聚糖凝胶纯化谷氨酸脱羧酶? .. 纯化的结果 .. 相对分子质量的测定. .乳酸片球菌谷氨酸脱羧酶的酶学性质研究?. ..底物浓度对活力的影响.. 浓度对活力的影响..不同温度对活力和热稳定性的影响 ..不同对活力和稳定性的影响??.. ..不同金属离子和化学物质对活力的影响? ..乳酸片球菌的动力学常数?. 第章结论.乳酸片球菌产培养基及发酵条件的优化 .乳酸片球菌的分离纯化?. 目录 .乳酸片球菌谷氨酸脱羧酶的酶学性质??. 参考文献? 赘【谢??. 独创性声明??. ?.谷氨酸脱羧酶概述 ,是生物内正常合成的一种酶 谷氨酸脱羧酶 蛋白,为脱羧酶。它的分布很广泛,从单细胞生物到哺乳动物的脑和胰岛组织中 都有的存在【。它是催化.谷氨酸.羧基进行脱羧反应生成中氨基丁酸 的关键限速酶和唯一酶【,而且专一作用于.谷氨酸【引. 催化谷氨酸脱羧的产物在人体中是一种重要的抑制性神经递质 【,具有重要的生理功能:如调节血压、促使精神安定、促进脑部血液循环、增 强脑动力、营养神经细胞、促进生长激素分泌、保肝利肾等刁】。随着人们对 生理功能的不断探究,发现开发生产类的食品和药物对人类具有深刻的意义 嗍。不仅如此,还极有可能作为特定的诊断酶来预测和区分糖尿病【】,所以深 入了解它的结构和特性对其未来的应用具有深刻的指导意义。目前合成的方 法多种多样,其中利用微生物来源的催化谷氨酸脱羧生成不受空间、 资源和环境限制,被人们广泛的使用。 . 的来源 人们在动物、植物以及微生物中都发现有的存在,如脊椎动物中枢神经 系统的神经元中,及非神经的组织睾丸、胰岛中:植物的茶叶【们、南瓜】、 小麦【、马铃薯块型中;以及在多种细菌、古生菌和真核微生物、 /、正】、 刀等中。这些都为人们研究提供了 广泛的来源。由于微生物具备其他来源所不具备的特点生长速度快、生长条 件 较简单、来源广泛和代谢过程特殊,所以使得微生物成为了生物酶的重要 来源。黑龙江大学硕士学位论文 ..动物来源的的研究状况 在自然界的低等生物,如昆虫类动物的脑中活力也较高。曾经有报道在 蟑螂、跳蚤、蚊子、虱子等昆虫中都发现了的存在。但不同昆虫来源的 的结构和性质却不相同。 等【】首次从鼠脑中成功的分离纯化得到鼠脑的。有这一成 功的先例后,生物学家就充分利用其他各种哺乳动物,并且从它们中的胰岛 组织 ? 和脑中分离提取到了。等【朝从猪脑细胞膜中成功得到与膜结合的 ,其纯化倍数接近倍、产率为.%。 等【捌将从猫中获得的用于编码的克隆到大肠杆菌表 达载体上,使其在大肠杆菌中得到表达,经纯化后得到有酶活性的。其纯化 倍数为倍,产率为%,它对谷氨酸的为.,等电点为.,最 适为.。 一 等】通过分子克隆,将人胰岛细胞通过杆状病毒裁体 层析, 在细胞中获得表达;经.或抗抗体. 得到有活性的。 ..植物来源的的研究状况 ? 植物来源的的研究,最初主要集中在稻米制品和茶叶中利用富集 。早在年,日本农林水产省茶叶试验场的津志田藤二郎率先开发成功 了含丰富的茶,他利用刚摘下来的新鲜茶树叶经过一系列的处理增加 的量,以此为原料制成的茶饮品具有降血压的功能,随后对它进行了商业 化包装来销售,并且将此茶命名为 【,即为哥氨基丁酸茶。 大半个世纪以前人们就从很多除茶树外其他植物中成功分离得到了。 等在年从几十余种植物的组织中成功分离得到了,阐明 由是蛋白质和磷酸吡哆醛构成的复合体。他们从胡萝卜中分离的最 第覃绪论 佳 ..,氰化物对其有抑制作用。和、得出胡萝 卜的最适为.。 和】共同对马铃薯块茎来源的进行了研究, 测定出其相对分子质量,并通过实验验证了该是由两个分子质量相同的 亚基构成,且它们的相对分子质量为。年,等用南瓜作为原 材料,分离得到了,经.电泳得到了单一条带的纯酶,其最适., 比大肠杆菌高出了个单位,此外,他们还通过沉降平衡实验证明,南 瓜是由六个相对分子质量同为的亚基组成的六聚体结构。 范军掣】对小麦中的进行了研究,得出其相对分子质量约为 的 ,是由个相对分子质量大小相同且为的亚基构成的,和. ’?结构相类似。研究还测得小麦的等电点为.,实际上这是辅基的等电点, . 一.由于携带负电,所以全酶的等电点要比研究所测得到的值略低一些,实验 还 得出小麦的最适在.附近。 二 ..微生物来源的的研究状况 人们在霉菌和细菌等多种微生物中都发现了的存在捌,其中以大肠杆 菌研究的最为深入。大肠杆菌 是一类具有较高活 性的微生物,早期许多研究者大多以大肠杆菌生产进行探讨。章汝平等 ? 固定化大肠杆菌细胞对后道味精母液提取谷氨酸后的废液进行转化生产, 获得含量达到.,回收率为.%。林少琴等】以壳聚糖为载体,戊 二醛为交联剂,固定化大肠杆菌谷氨酸脱羧酶丙酮粉用以生产,具有较好 的热稳定性、可操作性和贮存稳定性。 由于酶具底物专一性的特点,所以大肠杆菌只作用于.谷氨酸,对其它 类型的氨基酸不产生脱羧作用。它的最适.~.,在低蛋白质浓度、低温和 高于.时会很容易发生解聚而失活。大肠杆菌是由六个相对分子质 量相同且为亚基构成的】,同时每个亚基都与结合。等【婀 ? 的进行了分离纯 有关【?。等【】对 化,并且对它的酶学性质进行了研究。研究表明其最适温度为?,最适为 ” .,相对分子质量为,并且通过测序得知其含有氨基酸残基数为个其 中只含有一个基因。 综上所述,不同来源的,其结构和性质存在着一定的差异。即使是同一 . 来源的,其结构和性质亦不同,其最适条件、相对分子质量大小等方面有着 明显的差别。不同来源的的主要性质见表.。 表不同来源的的性质比较嘲忌 ? 我们同样还可以从表中还可以直观的看出的最适和其特性常数。 植物的最大,微生物的最小,动物则介于两者之间。这说明 了微生物与底物的亲和力最强。所以微生物来源的可以在较低的底物 浓度中进行催化反应。 . 活性的调节 是由酶蛋白与磷酸吡哆醛组成的,其中是的辅基, 它对的活性发挥起着至关紧要的作用【。在对脱羧反应过 程中的作用如下图所示: ? 图 在催化谷氨酸生成反应中的作用 . 由图可见,在谷氨酸被催化生成的反应中,其脱羧反应是通过 酶蛋白与形成复合物来完成的。反应过程中与不断地脱离与结合, 且随着浓度的增大,与酶结合形成复合物的量增加,反应速度加快,因此反 现腺嘌呤核苷酸抑制脱辅基酶蛋白的合成,若在除去核苷酸后加入,谷 氨酸脱羧酶即可恢复其正常的活性。核苷酸导致谷氨酸脱羧酶失去活性的顺 序是 脚。谷氨酸在没有时通过促进来导致失活;在 ? 一。 存在的时候谷氨酸就会促进,导致失活的作用就会进一步产生。 很长一段时间以来,人们都在研究活性的调控。根据最新的研究成果表 明:植物来源的是某种钙调素结合蛋白【“】,其活性受/ 调控。比如说矮牵牛花组织的就是一个相对分子质量为的/ 的蛋白质【习。人们在对蚕豆【勰】和大豆【等植物的进行研究时也发现, 的活性受/控制【,进而调控着和谷氨酸的代谢,而且这些都是 植物的正常生理需求。此外,植物体内的也影响着的活性,它们成反 比例的关系,当细胞质上升时,的活性就会降低。这是植物在热刺激、 机械刺激、冷害、盐胁迫等严厉的恶劣条件下,细胞内【和【 :浓度增加、 激 活,进而增加含量的机制。 . 常用的分离纯化方法 来源的不同,其分离提取的方法也不同。 穆小民【以林生山黛豆为材料,利用硫酸按分段盐析,丙酮沉淀, . 离子交换柱层析,凝胶过滤柱层析及 柱层析技术,分离纯化了谷氨酸脱羧酶。纯化后的林生山黛豆谷氨酸脱羧 酶活力达. /,纯化倍数.。 张晖【从粉碎后的米胚中分离提取到粗酶液,利用硫酸铵分级 凝胶过滤和 沉淀透析除盐,? 离子交换色谱、 第覃绪论 .亲和层析对提取液进一步纯化,得到纯化米胚。纯化 后的米胚纯化倍数为.,酶活力达./,酶活回收率为.%。 许建军【采用溶菌酶处理、超声破碎、硫酸铵分级盐析、次 凝胶过滤等手段,从乳酸菌细胞中层析和 分离纯化得到谷氨酸脱羧酶。纯化后酶的比活力达. /,纯化倍数, .得到亚基的相对分子质量为。 在分离纯化的过程中,由于某些生化试剂或蛋白水解酶引起了活 性或者构象的变化,所以目前仍需要通过大量的、缜密的、精细的实验研究 来掌 握高活性、高纯度、高产率的纯化方法,为人们分离纯化提供真实可 靠的依据。 . 常用的检测方法 由于无法被直接测定出来,所以要通过对的测定来间接测定 的存在。 ‘ .. 比色法 反应【澎】是利用苯酚、次氯酸钠与游离氨反应呈现出蓝色,进而测定 出不同体系中的微量氨。和蛋白质氨基酸在反应中的响应差别很 大,有很高的响应,可是小氨基酸响应却很低。的浓度越高,反应 后溶液呈现出蓝色的程度越深。因此,我们可以通过反应后溶液所呈现出蓝 色的 深浅来比较含量,进而判断出活性的强弱。此法】反应迅速,灵敏 度高,适用于大量样品的检测。 等】利用比色法测定豇豆来源的谷氨酸脱羧酶的活力,重现 性好,样品用量少。 许建军等【利用比色法测定乳酸菌谷氨酸脱羧酶活力,结果表明, 该方法灵敏度较高,成本低,快捷,可替代氨基酸分析仪分析法。所以在发酵研 黑龙江大学硕士学位论文 究和谷氨酸脱羧酶的分离纯化研究中,有大量酶活分析工作,比色法可快速测定 分级组分的相对酶活分布,使用样品量少、成本低,是一种很有效的方法。利用 比色法测定谷氨酸脱羧酶具有优势和可行性,是一种值得推广的实验测定方法。 ..氨基酸自动分析仪法 氨基酸自动分析仪原理【刀是利用各种氨基酸酸碱性、极性和分子大小等性质 的不同,使用阳离子交换树脂进行色谱分析,采用不同和离子强度的缓冲溶液 依次进行洗脱。洗脱下来的氨基酸与茚三酮进行柱后衍生显色,在最大吸收峰处, 用紫外可见光检测器进行分析检测。 该方法准确,操作简单,灵敏度高,但检测速度慢,不利于大量样品的检测。 ..高效液相色谱法 与蛋白质氨基酸一样,没有紫外和荧光吸收,很难直接检测,但可通 过衍生反应形成能够检测到的紫外或荧光吸收物质。因此,高效液相色谱法 与柱 前衍生技术相结合就可测定微量,已报道过的衍生化试剂有多种【.】,如 邻苯二甲醛、丹酰氯、,.硝基氯苯和异硫氰酸苯酯等。 此法准确度、灵敏度高,可用于测定微量,但检测速度慢,且药品毒 ? 性大,容易造成环境污染。 . 的功能与应用 目前发现猪脑中的和人的可作为胰岛素依赖型糖尿病 ,的抗原用来诊断和预防。 众所周知,是危害全人类健康己久的几大疾病之一。人们经过研究发现 产生的机理:在胰岛肛细胞的表面存在着某种特定的抗原,它可以与血清 中的自身抗体发生反应,进而造成细胞的损害,导致了的发生。除了 第章绪论 ,僵人综合症,,也是一种自身免疫缺陷性综合 症,这种症状发生的机理是因为神经系统受到了损害,它是由于自身抗体会 与其 分泌所产生的的神经元发生反应。在人们的实验验证中己表明这两种综合 症的自身抗原都是。有大量的临床数据显示早在此类症状出现的十年前,血 清中就能检测出抗体的存在。 针对这类自身性免疫疾病,如果对抗体自身抗原进行注入诱导免疫可 能会避免的发生。掣】给个月大的鼠注入, 发现可以降低发生胰岛炎的可能性,有效地延缓和预防了鼠糖尿病的 发生。所以是自身免疫反应的关键抗原。鼠最开始的时候对 的自发反应引起了一系列的连锁反应,导致了对细胞其他抗原起反应的细胞 在胰岛处汇聚,其实这个反应是可以预防的,就是采取灭活的反应性细胞 的方法【。等的研究发现,如果在鼻腔内注入可有效降低 胰岛炎发生的可能性,并且还能预防糖尿病的发生。如果对和基因重组的 , 进行纯化,尤其是重组的获得,就能为的预防及免疫治疗提供 有效的保障。 常用来制备的酶是. ,利用它制备所得的一般都用在 化工上:酵母菌、乳酸菌和曲霉菌等微生物中的也常被用来制备类 的食品陋埘。最新的研究表明,. 技术、检测. 的 活性技术还可以作为水和食品中.粗筛的标志【舶】,通过此法与其它毒素基 因 相结合还可以作为食品和水中致病性.的鉴定标志【嗍。 综上所述,随着生物技术手段的发展,在生物界中的重要意义和生理作 用已经引起了研究者们的普遍关注,目前人们研究的热点和难点是对结构差 异形成的原因、结构与功能的关系的探宄和基因表达的调控。从世纪中期开 始 到目前为止,学者们把工作的重点放在有关微生物中的研究。 黑龙江大学硕士学位论文 .本课题研究的目的和意义 可作为胰岛素依赖型糖尿病 ,的抗原 用来诊断和预防,对进行纯化,能为的预防及免疫治疗提供的 保障。 催化的产物具有调节血压、增强脑动力等重要的生理功能,开发 类的食品和药物对人类具有深刻的意义,而利用乳酸菌生产 是目前的研究热点。 此外,若能从低等生物中成功获得有关的信息,将有助于人们更好更快 地解决和之间的关系,及其在高等生物中的一些生理特点等问题。 片球菌是一类应用于食品工业安全的微生物。片球菌的代谢产物片球菌素 具有天然安全和耐热耐酸的特性,它作为一种生物防腐剂在食品发酵和 食品保藏中得到广泛的研究及应用【叨。乳酸菌被美国作为一种食品安全级 一 的微生物,在食品工业中的应用非常广泛并且历史悠久,乳酸菌在人和动 植物体内定植并产生大量有益健康的成分,被誉为重要的益生菌。乳酸菌制 品的 健康功效使其具有巨大的市场和开发价值。本研究对实验室保存的乳酸片球 菌 .和其他菌株进行了前期的试验,发现它代谢.谷氨酸合成的能力 高,说明其中的活性高。所以鉴于是自身免疫反应的关键抗原及 ? 生产的关键酶,本研究通过对乳酸片球菌产培养基、培养条件优化, 并利用各种方法分离纯化,研究的相关酶学的性质,为日后的研究 和应用提供参考价值。 第章材料与方法 第章材料与方法 .实验材料 ..实验用菌株及保存方法 乳酸片球菌:黑龙江大学发酵工程实验室保存。此菌株在固体培养基上 ‘ 培养,保存,每两周转接一次。 ..培养基 液体培养基:葡萄糖 /,酵母提取物 /,牛肉膏 /,蛋白胨 , /,磷酸氢二钾 /,柠檬酸氢二铵 /,无水乙酸钠 /,吐温一 . ./,? /,加蒸馏水定容至 ,调 至..,?灭菌 固体培养基中加%琼脂。 ’ 发酵培养基:葡萄糖 /,无水乙酸 /,酵母提取物. /,蛋白胨 . . . 钠 /,? /, /,’ /,? . /,加蒸馏水定容至 ,调至.,?灭菌。在发酵培 养基中加入一定量的前体物质谷氨酸.,简称作 为底物,与其他成分分开灭菌,?灭菌。 ..主要实验用试剂及配制方法 色谱纯,.%,购于公司; 丫.氨基丁酸标准品 溶菌酶及磷酸毗哆醛购于上海生工;考马斯亮兰.,牛血清白蛋白均 购自中国医药集团上海试剂公司;谷氨酸钠购于国药集团上海化学试 一 为公司产品;溶菌酶活力 剂公司: /购自上 海宝丰生化公司;硫酸铵等其他试剂均为分析纯。黑龙江大学硕士学位论文 固体定容于,其他浓度 标准溶液:准确称取. 的标准溶液由此稀释制得,于保存备用: .谷氨酸固体定容至,其他 谷氨酸标准溶液:准确称取. 浓度的标准溶液由此稀释制得: 次氯酸钠:有效氯含量%。 、.巯基乙 粗酶缓冲液:含有./溶茵酶、./ 醇的/.的磷酸盐缓冲液; . 底物缓冲液:内含./和/.的., 的底物缓冲体系。 缓冲液:由?和?溶液以 .的. :的比例混合而成。 电泳所需试剂如下: ?丙烯酰胺和,’一亚甲双丙烯酰胺。以温热的去离子水利于溶解双丙烯酰 ? 胺配制含有/的丙烯酰胺和%/的’.亚甲双丙烯酰胺的储 存液,置于棕色瓶子?保存。 ?%十二烷基硫酸钠。 ?’’,’.四甲基乙二胺、%过硫酸铵现用现配 ?. .嘣缓冲液分离胶缓冲液、%,.缓冲液浓缩胶 一 缓冲液。 , 董.甘氨酸电泳缓冲液: 甘氨酸.,.%。 ?样品处理液: .,%巯基乙醇,%,.%溴酚 蓝,%甘油。 ?染色剂:.%考马斯亮蓝,%甲醇,%冰醋酸。 ?脱色剂:%甲醇,%冰醋酸。 .数据横流泵 上海精密科学仪器有限公司 .梯度混合器 上海精密科学仪器有限公司 .台式 记录 混凝土 养护记录下载土方回填监理旁站记录免费下载集备记录下载集备记录下载集备记录下载 仪 上海康华生化仪器制造厂 真空冷冻干燥器 北京普析通用仪器有限责任公司 高速冷冻离心机 长沙湘仪离心机仪器有限公司 .型电热恒温培养箱 上海精宏实验设备有限公司 .型电热恒温水浴锅 上海精宏实验设备有限公司 .制冰机 宁波市格兰特制冷设备制造有限公司 昆山市超声仪器有限公司 型超声细胞破碎仪 .型座式自控电热压力蒸汽灭菌器 日本三洋 型电子天平 梅特勒.托剩多仪器厂有限公司 双人超净工作台 苏州净化设配有限公司 凝胶成像系统 公司美国 .试验方法 ..菌株活化、扩培、接种与发酵 从保存的乳酸片球菌斜面上挑取环茵转接到另一个斜面上,培养 后转接入液体培养基中,培养~。以%的接种量接入到含. 的发酵培养基中,以/的装液量于?静止培养.. 黑龙江大学硕士学位论文 .. 比色法测定活性 在反应中,苯酚和次氯酸钠的浓度对比色结果有一定的影响,因 此应对其浓度进行确定。 ...苯酚浓度对酶活的影响 取底物溶液和粗酶液,将两者充分混匀后于?反应, 迅速置于冰浴中,同时加入./ .的硼酸缓冲液终止反应,混匀 后分别加入配制好的.浓度为%、%、%、%、 %的苯酚溶液和叫 的次氯酸钠溶液,充分振荡后,沸水浴反应,迅速在冰浴中冷却显色, ‘ 测定‰值。 ...次氯酸钠溶液的添加量对酶活的影响 分别加入%次氯酸钠溶液.、.、.、.、.、.,苯酚溶液采用最 佳值,其它方法同...,测定仞‰值。 ...比色法标准曲线的绘制 和/ 在“底物溶液底物缓冲液,./ 的./.中加入浓度梯度/、/、/、/ 和/的标准样品,将两者充分匀合后于反应,反应结 束后迅速置于冰浴中,此时加入./ .的硼酸缓冲液终止反应, 混匀后再加入最佳量的苯酚和次氯酸钠溶液,充分振荡后,沸水浴反应,迅 速在冰浴中冷却显色,然后测定‰处吸光值。以的浓度为横坐 标,仞‰为纵坐标绘制标准曲线。 ...样品酶活力的测定 用待测酶样代替不同浓度标准样品进行酶活力测定,测定结果利用标 准曲线计算酶活力,其它方法同...,测定仞‰咖值。 ...乳酸片球菌生长曲线的测定 向液体培养基中接入%的乳酸片球菌,装液量/,静 置培养,每隔取样,测讯胁值,绘制生长曲线。 第章材料与方法 ..乳酸片球菌产培养基及发酵条件的优化 ...底物.谷氨酸的浓度对产量的影响 分别在发酵培养基添加.、.、.、.、./的.谷氨酸,装液量为 /,静置培养。离心取发酵上清液,预处理后,利用比色法测 定‰值,分析不同浓度底物对发酵合成的影响。 ...葡萄糖添加量对产量的影响 配制葡萄糖的添加量分别为、.、、.、、.、/的发酵培养 基,并加入最佳量的谷氨酸钠,装液量/,静置培养。离心 取发酵液的上清液,预处理后利用比色法测定‰值,确定最佳葡萄糖添加量。 ...酵母粉添加量对产量的影响 分别配制酵母粉添加量为.、.、.、.、.、.、./的发酵培 . 养基,其他成分采用最佳量,方法同...,确定最佳酵母粉添加量。一 ~ ...蛋白胨添加量对产量的影响 一 分别配制蛋白胨添加量为.、.、.、.、./的发酵培养基,其他 成分采用最佳量,方法同...,确定最佳蛋白胨添加量。 ’、 ...初始对产量的影响 配制初始分别为.、.、.、.、.、.、.的发酵培养基,培养 基成分采用最佳量,方法同...,确定最佳初始。 ...培养温度对产量的影响 培养基成分采用最佳量,分别在?、?、、、?下静置培养 ,方法同...,确定最佳培养温度。 ...不同接种量对产量的影响 采用最佳培养基及培养条件,接种量分别为、、、、%,方法同..., 确定最佳接种量. ...乳酸片球菌产发酵终点的测定 乳酸片球菌发酵时间不同,谷氨酸脱羧酶的产量也不同。从含谷氨酸钠的 黑龙江大学硕士学位论文 发酵培养基中取样,每隔测一次酶活,确定酶活力最高时的产量的发酵 时间。 ...正交实验确定最佳的培养基配方与发酵条件 根据单因素试验的结果影响产量的主要因素为蛋白胨浓度、酵母粉浓 度、葡萄糖浓度以及起始,确定正交实验的因素和水平。本实验采用因素 水平的正交试验,具体 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 见表.。 表正交试验 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 方案 ? ..乳酸片球菌谷氨酸脱羧酶的分离纯化 由于是的辅基,如果没有,则酶无活性。所以本实验在分离纯 化的所有过程中,均在缓冲液中添加一定量的。 ...菌体细胞的培养与收集 从保藏的乳酸片球菌的斜面上刮取环菌接入另一个斜面上,恒温静 止培养后转接入液体培养基中,恒温静止培养。以%的接 种量接入到含.谷氨酸钠的发酵培养基中,/的装液量,静止培 /离心收集各时期的菌体,用浓度为/ . 养后, 的磷酸盐缓冲液充分洗涤菌体细胞三次后,离心去上清,得菌体细胞备用。 .. 粗酶提取液的制备 第章材料与方法 将离心得到的菌体细胞分散到含./的,./的溶 菌酶,/巯基乙醇的缓冲液中,静置反应。置于冰浴中,超声 波破碎操作条件为:工作/间歇时间/,超声功率为,全程。 /,冷冻离心,除去细胞碎片,得上清液,加入固体硫酸铵至饱和 度为%,静止放置一夜, /离心,收集沉淀,溶于少量的磷酸盐 缓冲液,放入经过处理的透析袋中透析,用氯化钡检测至检测不到‘时,该透 析液就是粗酶液,放入冰箱中保存备用。 ... 离子交换层析纯化谷氨酸脱羧酶 /离 将粗酶液经冷冻干燥后的酶样,溶于的缓冲液中, . 缓冲液冲洗平 心,取上清液上柱妒.。上柱前,用. 衡柱子,使其内环境成为的最适条件。上柱后,先用缓冲液流经柱子后,采 取经反复试验确定?. 进行梯度洗脱,洗脱流速为./。分部 收集并检测以及酶活,绘制洗脱曲线。 ? 离子交换层析柱的酶液经透析除盐,浓缩后,进行 将经过 下一步的分离纯化。 ... .葡聚糖凝胶纯化谷氨酸脱羧酶 .葡聚糖凝胶分离蛋白质的范围相对分子质量为 由于 ~. ,而目前研究所发现的乳酸菌的相对分子质量在此范围内。所 ? 以本实验选用.葡聚糖凝胶进一步纯化。 .葡聚糖凝胶溶胀、装柱.,用?倍柱体积. 的. 离子交换柱 缓冲液平衡柱子。然后取经 分离纯化得到的酶样,上样,用含 的缓冲液洗脱,控制 流速为/,分部收集,检测以及酶活,绘制洗脱曲线。 ... .电泳法测定 配制.所需的各种试剂,安装玻璃板,在两玻璃板的间隙中灌注丙 烯酰胺溶液,留出灌注浓缩胶所需空间,再在胶页面上小心注入一层水,以防 止 氧气进入凝胶溶液。待分离胶聚合完全后,倾出覆盖水层,再用滤纸吸净残留 水。 黑龙江大学硕士学位论文 灌注浓缩胶,在浓缩胶溶液中插入干净的梳子。小心避免混入气泡,将凝胶垂 直 放置于室温下,聚合后,移出梳子。把凝胶固定于电泳装置上,上下槽各加入 一 甘氨酸电极缓冲液。 样品预处理:在样品中按:体积比加入样品处理液,在。力热分钟以 使蛋白质变性。按预定顺序加样,加样量为此。 将电泳装置与电源相接,凝胶上所加电压为/。当染料前沿进入分离胶 后,把电压提高到/,继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部上方约,关 闭电源。取下凝胶,用考马斯亮蓝对染色砣,脱色,至背景清楚。 利用凝胶成像系统进行成像。并利用迁移率测定乳酸片球菌相对分子质 量。 ...酶液中蛋白质浓度测定 采用考马斯亮蓝染色法,标准样品用牛血清白蛋白。 ..谷氨酸脱羧酶酶活力的测定 酶活力的测定,采用...方法。一个酶活力单位定义为:每分钟生成 /所需的酶量相对酶活力以单位时间内仞‰的变化表示,以最 高的‰为参比计算相对酶活。 ..谷氨酸脱羧酶性质的研究 ? ...底物浓度对活力的影响 取组斗含浓度分别为、、、、、的 的底物溶液,加入止的粗酶液,充分混匀后反应,反应结束后迅 ./ 速置于冰浴中,加入. .的硼酸缓冲液终止反应,再加入. 的%苯酚和“的次氯酸钠溶液,充分振荡后,于沸水浴中反应,迅速 在冰浴中冷却显色后,测定‰值。 ...酶浓度对活力的影响 取组的底物溶液,分别加入、、、、的粗酶液不 ...反应温度对活力的影响和其热稳定性的研究 分别取底物溶液和.粗酶液充分混合后于?、?、?、、 ?、?、?、?、、、?反应,反应结束后迅速置于冰 ? 浴中,其他方法同...,测定仞‰值。对的热稳定性的试验,分别取 。底物溶液和.粗酶液充分混合后于?、、?、、?、 反应,反应结束后迅速置于冰浴中,其他方法同...,测定例‰值。 ... 对活力的影响和其稳定性的研究 分别取止为、、、、、、的底物溶液,和.粗酶液充分 混合后反应,方法同...,测定例嘶值。对的稳定性 的实验,分别取上为.、、.、、.的底物溶液,和粗酶液 充分混合后反应,方法同...,测定例嘶值。 ...不同金属离子和化学物质对活力的影响 分别配制浓度为/的、、、、、、 ? 和溶液,然后与相同体积的酶液混匀,在?反应,反应 结束后测定剩余的酶活力,以未添加金属离子和化学物质的酶活力溶液为%, 然后用比色测酶活的方法来计算加入金属离子和化学物质后的酶液的相对 酶活。 ...乳酸片球菌的动力学常数 值是乳酸片球菌的一个重要酶学特性常数。本实验采用 双倒数作图法,经线性拟和得到回归直线,计算乳酸片球菌 的和的值。 取“的酶液,分别与的浓度为//的底物溶液 在最适的温度和下反应,测不同底物浓度条件下的酶反应初速度,以 黑龙江大学硕士学位论文 反应初速度的倒数与底物浓度的倒数/进行双倒数作图。 ? ?第章结果与分析 .谷氨酸脱羧酶活力的测定 ..苯酚浓度对活力测定的影响 利用比色法测定酶活力时,反应体系中分别添加.的%、%、%、%、 %苯酚溶液,测定其倒‰姗值。结果见图。 言茜一 仉仉仉仉吼仉仉饥 苯盼浓度? 图.苯酚浓度对产量的影响 . 由图可以看出,随着苯酚浓度的增加,吸光度值‰也随着增加。当 苯酚浓度达到%的时候,吸光度值也达到最大,说明此时的活力最大。所 以在用比色法测酶活力时,添加浓度为%的苯酚。 ? ..次氯酸钠溶液添加量对活力测定的影响 利用比色法测活力时,反应体系中分添加.、.、.、.、.、./. 的次氯酸钠溶液,利用比色法测定其嘶值。结果见图。 加量为.的时候达到最大值,说明此时的活力最大。但是在添加量超过 .之后,吸光度值开始下降,说明过量的次氯酸钠溶液会抑制的活力。 因此在用比色法测酶活力时,次氯酸钠的添加量为.。 .?标准曲线的绘制 ? 分别取浓度为、、、、的 标准液,与底物溶液混合,利用比色法测定其例‰值,绘制标准曲线如图。 ? 舌 葛“队浓度/ 图比色法绘制的标准曲线 , .? 通过图.可以看出,.,说明标准品与它的吸光度值有很好 的线性关系,所以可利用此法检测的产量及活力。. ?恐 勰培养时间 图乳酸片球菌生长曲线的测定 . 由图可以看出;培养时间乒是乳酸片球菌的对数生长期,是 乳酸片球菌的生长平稳期。所以菌种扩培时,选择培养时间为的生长对数 期乳酸片球菌。 .影响谷氨酸脱羧酶产量的因素 ..底物的添加量对产量的影响 ? 在发酵培养基中,分别添加、.、、.、/的谷氨酸,发酵后, 测定其在姗值,结果见图?。黑龙江大学硕士学位论文 仇 舌葛 . . 添加量/ 图底物的添加量对产量的影响 ?.由于可以催化谷氨酸脱羧生成,所以广谷氨酸的添加量直接 影响的产量。由图.可以看出,随着.谷氨酸添加量的增加,酶活力也在 增大,的产量也增大。而当谷氨酸的添加量达到/时,的酶活力 最大,当.谷氨酸的添加量大于/时,的酶活力开始降低。由此说明, 在发酵过程中添加适当浓度的谷氨酸可以促进的产生,但是过量的添加又 ? 会产生抑制其酶活力的作用。因此可以确定谷氨酸的添加量为/。 ..培养基的主要成分及发酵条件对产量的影响 ...葡萄糖添加量对产量的影响 在发酵培养基中分别添加不同量的葡萄糖,经一定时间的发酵后利用比色 法测定其纠‰值,以此来比较葡萄糖对产量的影响。所得结果见图。 由图.可以看出,当葡萄糖的添加量为/的时候,的酶活力达到 最大,即的产量最高。而当继续添加葡萄糖时,对的产量产生抑制作 用。因为葡萄糖这样容易利用的碳源,其分解代谢产物会阻遏体系编码的 基因转录的现象,从而降低了的产量。所以可以确定葡萄糖的添加量为 /。第章结果与分析 寸?一盘 仉仉 ? . . . 葡萄糖涿加量/ 图葡萄糖添加量对产量的影响 . ...酵母粉添加量对产量的影响 本实验以不同添加量的酵母粉加入到发酵培养基中,经一定时间的发酵后 利用比色法测定其‰值,所得结果见图?. 舌 葛 饥仉仉仉饥仉 . . . . . 爵母添加量/ 图.酵母粉添加量对产量的影响 .由图.可以看出,的产量随着酵母粉添加量的增大而增加,当酵母粉 添加量达到 ./时,的活力达到最大。但是酵母粉再增加的话,的 活力降低,所以可以确定酵母粉的添加量为./。 ...蛋白胨添加量对产量的影响 本实验以不同添加量的蛋白胨加入到发酵培养基中,经一定时间的发酵后 利用比色法测定其‰值,所得结果见图。