微生物降解餐饮废弃油脂研究（可编辑）

微生物降解餐饮废弃油脂研究（可编辑） 微生物降解餐饮废弃油脂研究 华南师范大学硕士学位论文 微生物降解餐饮废弃油脂的研究 张苇 导师姓名职称: 马广智教授 专 业: 水生生物学 院 系: 生命科学学院 答辩时间: 2010(5(28 ltlll l I IIIT I 1 I T IIII ITI ,1 Stud n h foo il radation o t e dwasteo de y g ? ? ? mICroDe DV ZHANG Wei ecialt drobi0l0 Sp y: ny gY Col1e e: Co11e eofLife Science g g Sor:ProfeSsorMA Supervi Guang(zhi SubmittedDate: 2 010 8，2 May 微生物处理餐饮废弃油脂的研究 专业:水生生物学 姓名:张苇 导师:马广智教授 摘要 本研究从餐厅下水道采集水样和垃圾场土壤中采集土样， 建立有效的初筛和复筛体系，经过大量的菌种筛选，分离得到 l8’株降解油脂能力较高的菌株，等量混合制成混合菌液，其油 脂降解效果明显优于单一菌株。 利用单因素实验，研究了在不同的PH值、 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 面活性剂、 温度、摇床转速及初始油脂浓度条件下，已筛选出的菌株对油 脂的降解率。实验结果表明，最佳培养条件是pH值8(0、 0(3 Tween(8 5?、摇床转速为 0的浓度 800mg,L、温度为3 l80(2 00r,min、初始含油量 800mg,L，碳源为花生油时其降解 率最高，可达84(7,。筛选出的混合菌株对芝麻油，猪油和从 餐厨垃圾中萃取出来的废弃油脂也有较好的降解效果，降解率 分别为79(3,，76(4,和74(6,。 利用筛选出来的混合菌株在室温下处理餐厨垃圾，第一天 到第四天餐厨垃圾中的油脂降解速率较快，第四天后趋于缓慢， 7天后加入混合菌的餐厨垃圾中粗脂肪含量由 10(7,降低到 (3,，餐厨垃圾中的油脂得剑了有效的降解;空白对照组粗脂 4 0(6,仅仅降 肪含量也有所降低，7天后粗脂肪含量有原先的1 到9(1,，但降解效果远不如实验组。 关键词: 餐饮废弃油脂混合菌生物降解 ABSTRACT onthefoodwasteoil by Study degradation microbe Major:Hydrobiology Name: ZHANGWei MA Supervisor:ProfessorGUang―zhi ABSTRACT Inthe andthree strainswere study，sixty 1ipase-producing from0i1一containedincloacaandearth isolated sewage samples withhi inrefuse of ofthem dumpuniversity(Andeighteen gher ofoil werefoundafter capability degradation effectively and method(The primarysecondaryscreening equalhigh ofmixed oil strainsmade efficiency microorganisms，the ismuchbetterthana strain( degradation single inthe to factormethodwasused study Single experiments theinfluenceon rate(Therewereseveralfactors: oil―degrading theinitialcontentofoiland value， lipid，surfactants，PH nutriments(Theresults temperature，diSSOlvedoxygen，carbon indicatedthatthe cultureconditionswereasfollow:oil optimal ofTween一80lessthan800 lessthan800 content mg,L， mg,L，the PHvalue 30(35?，diSS01ved initial 8(0，temperature 180―2 nutrimentsoil(In OXygen 00rpm，carbonpeanut optimum condition，ithadthe was rale，which highestOil―degrading microbeshavebetter ofsesame 84(7,(Themixed degradationoil， lardandwasteOiIextractedfromthefood were waste，which 74(6,( 79(3,，76(4,and ofmixed todealwith food Using microorganismspractical ? ABSTRACT hasfaster of0ilin wasteatroom rate temperaturedegradating thefirstfour toslowafterthefourth crude day，tends day，which decreasedfromtheinitiall 0(6,to fatCOntent 4(3, afterseven thecrudefatcontentofthecontrol decreased days(And group from1 0(6,to9(1,afterseven ismuch days(Thedegradation lessthan experimentalgroup( Wa mixed WOrdS:thefoOdsteOil KeY bio-degradation ?I 第二章油脂降解菌的筛选„„„„„„„„„„„„„((13 2(1材料和方法„„„„„„„„„„„„„„„„„13 2(1(1实验材料„„„„„„„„„„„„„„„„(13 2(1(2实验方法„„„„„„„„„„„„„„„„(15 2(2结果与讨论„„„„„„„„„„„„„„„„„17 2(2(1菌种筛选结果„„„„„„„„„„„„„„„17 2(2(2菌种分离纯化结果„„„„„„„„„„„„„((20 2(3本章小结„„„„„„„„„„„„„„„„„((21 第三章微生物降解油脂条件优化„„„„„„„„„„„((24 3(1材料和方法„„„„„„„„„„„„„„„„„24 3(1(1实验材料„„„„„„„„„„„„„„„„(24 3(1(2实验方法„„„„„„„„„„„„„„„„(25 3(2实验结果与讨论„„„„„„„„„„„„„„„((25 3(2(1油脂初始浓度对混合菌降解油脂能力的影响„„„„„„(25 3(2(2pH值对混合菌降解油脂能力的影响„„„„„„„„(26 3(2(3温度对菌株降解油脂能力的影响„„„„„„„„„((27 3(2(4表面活性剂 Tween(80 浓度对混合菌降解油脂能力的影响„((28 3(2(5摇床转速对菌株降解油脂能力的影响„„„„„„„„(30 3(3本章小结„„„„„„„„„„„„„„„„„((30 第四章油脂降解菌的应用„„„„„„„„„„„„„„32 4(1材料和方法„„„„„„„„„„„„„„„„„32 4(1(1采样„„„„„„„„„„„„„„„„„((32 4(1(2样品制备„„(((„„„„„„„„„„„„„((32 4(1(3仪器设备„„„„„„„„„„„„„„„„(33 IV 目录 4(1(4试剂„„„„„„„„„„„„„„„„„((33 4(1(5实验方法„„„„„„„„„„„„„„„„(33 4(2实验结果与讨论„„„„„„„„„„„„„„„((36 4(2(1花生油、芝麻油和猪油降解实验„„„„„„„„„((36 4(2(2降解菌处理餐饮废弃油脂实验„„„„„„„„„„(40 4(2(3降解菌处理餐饮垃圾实验结果„„„„„„„„„„(41 4(3本章小结„„„„„„„„„„„„„„„„„((42 结论与展望„„„„„„„„„„„„„„„„„„(43 参考文献„„„„„„„„„„„„„„„„„„„44 致谢„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„(48 攻读硕士学位期间科研情况„„„„„„„„„„„„„((49 V 第1章绪论 第一章绪论 中餐的餐厨垃圾特点是量大含油脂高，经过简单的水油分离处理后提 炼生 物柴油用作燃料或工业原料，余下的餐厨垃圾油脂含量依然较高，但经微生 物 降解油脂后可作为饲喂蚯蚓的培养基。因此，筛选高效降解油脂的菌株对于利 用生物学方法处理餐厨垃圾是很有价值的。 数量巨大的餐厨垃圾若和城市其他垃圾混在一起进入垃圾收运体系，不仅 产生令人不快的气味影响周围环境，而且餐饮废弃油脂直接影响城市排污系统 的运行。一方面由于其影响水体的复氧及其自然净化过程，危害水体生态系统， 严重污染周围环境，另一方面也容易造成排污渠道堵塞而引起其他负效应 袁 惠民，1998 。 首先，由于餐厨废弃油脂往往含有大量不洁成份和致病菌，如不经过治理 而直接拉去喂猪等牲畜，很容易导致这些牲畜传染上疾病，而再由食物链传 染 给人。流行的猪口蹄疫，疯牛病等瘟疫被证实就可以通过食物链传染。其次， 从卫生防疫角度来说，餐饮废弃油脂经过一些地下作坊的露天提炼制成“地沟 油”，根本无法除去废油脂中细菌的有害化学成分，流入市场后严重危害人们身 体健康。因此研究和开发处理餐厨垃圾废弃油脂的技术，对保护人类的身体健 康有十分重要的意义 秦华明，2007 。 本研究课题的开展和应用，不但对保护环境和人类身健康具有十分重要的 意义，而且还符合当今国家的产业政策，实现资源的循环利用。因此，本课题 是探索一种科学有效的餐厨废弃油脂处理和综合利用途径，特别是用于配制蚯 蚓培养基的综合利用的方法，变废为宝，同时能够消除餐饮废弃油脂对城市 的 环境污染，具有十分重要的理论和实际意义。 1(1研究背景 本论文研究内容是《餐厨垃圾资源化处理》课题的一一部分，是利用蚯蚓对 餐厨垃圾进行无害化和资源化处理的新技术，餐厨垃圾油脂成分过高是困扰利 用餐厨垃圾养殖蚯蚓的技术难题，而本研究就是探索利用降解油脂微生物对餐 饮垃圾进行前期处理。 华南师范大学硕士学位论文 1(1(1餐厨垃圾及蚯蚓处理法 在我国城市生活垃圾构成中，餐厨垃圾的比例约为37,(62,。据统计2000 年我国餐厨垃圾产生量为4500万吨，并且以每年约lO,的速度递增，年新 增 餐厨垃圾产生量达500万吨 刘新英，1994 。而目前我国大多数城市对餐厨垃 圾的管理基本处于排放单位自行处置的状态。这直接导致了餐厨垃圾的三个 主 要流向:其一，大部分未经处理，被收集起来直接养鸡喂猪;其二，少部分餐 厨垃圾被人拉去提炼“潲水油”重返餐桌;其三，部分餐厨垃圾没有经过分类， 和其他城市生活垃圾混在一起进入垃圾收运体系或者直接倒进城市排污系统。 以上这些不仅带来了食品安全问题，继而会危及人民群众的身心健康，而且增 大了垃圾处理难度，因此引起了社会的广泛关注。建立餐厨垃圾有效的管理体 系和开发高效的治理技术已刻不容缓，这种呼声已处处可闻。 Hansenet et 98 a1(，l 1;李晶等，2004;梁继东等，2006; a1(，2007;Hartenstein 梁政等，2004 。蚯蚓处理法是指利用蚯蚓特殊的生态学功能，与环境中微生物 协同作用而加速有机物质分解和转化的处理技术 崔美香等，2006 。研究表明， 蚯蚓每天能消耗超过一半于它自身体重的有机废料并使废料的体积减少大约 50,，从而减少了废物的占地面积并节约了它们的运输费用 张宝贵，1997; 张宝贵等，2000 。另外，蚯蚓处理能降低原废弃物中挥发性有机质的含最， 促进水溶性C、N、P的转化，实现有机质的稳定。而且，蚯蚓还可消除餐厨废 弃物中的病原体，富集土壤中的重金属，达到生物净化土壤的目的 宾冬梅， 2006 。 蚯蚓处理不仅能实现理想的环境效益而且还产生了两种非常有用的产物: 蚯蚓和蚓粪，前者可进一步加工为蛋白质产品或从中提取蚓激酶等有用物质 邱 江平，2000 ;后者同样为一种非常有价值的产品，因为它质地均匀、透气性 好、持水力强、无臭且富含植物所需并易为植物利用的营养元素，是一种高级 的园艺肥料;而且，进一步的研究表明蚓粪对植物病害也有一定的抑制作用 李 o 东阳，2003 蚯蚓处理技术工艺简单、费用低廉，能获得优质有机肥和高蛋白饲料，不 产生二次污染并能最大程度地实现餐厨废弃物的资源化，从而越米越受到人 们 ’ etal(，2008 。 的重视 Rajiv 蚯蚓不喜食酸质多的食物，对酸碱度i艮敏感，多数品种喜好中性环境 2 第l章绪论 Neuhauseret a1(，1980;Edwards，1995 。蚯蚓要靠皮肤吸收大气扩散到 基料里的氧气进行呼吸，通气越好，其新陈代谢越旺盛，不仅产卵多，而且成 熟期短 陈德牛，1997 。但未经处理的餐厨垃圾中废弃油脂含量高，又富集在表 面上，对空气进入其内部起到一定阻碍作用，而且餐厨垃圾pH值很低，这些因 素影响蚯蚓取食利用餐厨垃圾配置的基料，进而影响蚯蚓的生长和繁殖。因 此 在利用餐厨垃圾配置蚯蚓饲养基料之前必需要降低餐厨垃圾中的废弃油脂的含 量。 1(1(2餐饮废弃油脂及其危害 餐饮废弃油脂是指居民日常生活以及除居民日常生活以外的食品加工、饮 食服务、单位供餐等活动中产生的不可再食用的动植物油脂和各类油水混合物。 吕凡等，2003 。 随着人民生活水平的提高以及餐饮业的增多，排放的泔脚垃圾，即所称的 剩菜剩饭也越来越多，其成分复杂，动植物油脂含量高，经测定餐饮垃圾中 粗 脂肪含量达29(07,，餐饮废弃油脂属于难生物降解的有机物，是一个高度污染 源，如果不能正确处理，给人们的生产生活带来一系列负面影响，并造成严 重 的环境污染 闫亚娟，2007 。 餐饮废弃油脂在水中主要以四种状态分布: 1 浮油:这种油在水中分散颗粒较大，油粒径一般大于lOOum，静置后能 较快上浮，以连续相的油膜漂浮在水面。 2 分散油:油在水中分散粒径为10―100um，以微小油珠悬浮于水中，不稳 定，静置一定的时间后往往形成浮油。 3 乳化油:油珠粒径小于10um，一般为0(1(2um，往往因水中含有表面活 性剂使油珠形成稳定的乳化液。乳化油的稳定性取决于废水的性质及油滴在水 中的分散度，分散度愈大愈稳定。 4 溶解油:油以分子状态或化学方式分散于水体中，形成稳定的均相体系， 粒径一般小于几微米。 漂浮于水体表面的油影响空气(水体界面上氧的交换。据调查，一滴油流入 水面后可形成0(25m2的油膜。2000L油在lO小时左右即可在水面扩肛成 200cm2、0(2nm厚的油膜。形成的油膜隔绝空气，阻碍水体的复氧，阻隔了水 体中氧的来源。同时，水体中的溶解油和乳化油在被水中好养微生物氧化分解 华南师范大学硕士学位论文 过程中，也消耗水体中的溶解氧。上述两个因素的共同作用会使水体中的C02 浓度增高，pH值下降，致使水生生物丧失生存条件。另一方面，微生物在分解 过程中产生诸如长链脂肪酸等对水生生物也有毒害作用 慎义勇， 油类的 2000 ，从而使水体中的生态系统的平衡遭到破坏。餐饮废弃油脂流到自然水体 中，浮油形成油膜后会阻碍大气复氧，断绝水体氧的来源;而水体中的乳化油和 溶解油，由于需氧微生物的作用，在分解过程中消耗水中的溶解氧，使水体形 成缺氧状态，以致鱼类和水生生物难以生存。因此，这些有机物如不经处理而 排放到江河湖海，飘浮于水体表面，影响水体的复氧及其自然净化过程，危害 水体生态系统，严重污染周围环境 袁惠民，1998 。 宾馆、酒店等餐饮业的含油脂废水若未经处理直接排入城市生活污水处理 装置，其中的油类物质包裹在填料外层令氧的传递受阻，导致好氧微生物代谢 韦朝海等，1996 。有时油脂紊乱，影响处理效果，有可能使处理系统崩溃 会 在管道中凝聚，有可能就会发生堵塞，从而在厌氧的环境下厌氧菌分解产生气 体，严重的就会发生爆炸。在美国就曾经发生过由于油脂堵塞生活污水管网而 引起的爆炸事件。 餐饮垃圾营养丰富，具有可回收利用价值。一般大宾馆、饭店、食堂将潜 水以一定的价格销售给一些个体养殖户，这此养殖户把收回的餐饮垃圾简单加 热，甚至不加处理，就用作饲料，进而产生所谓的“垃圾猪’’、“垃圾羊"。由于 餐饮垃圾中含有的油以及动物性蛋白，不符合动物食物链，长期使用这些饲 料， 其肉质质量下降，又由于泔水中含有未被杀死的病原体，这些病原体寄生在猪、 羊的体内，再以食物链的形式进入人体，进而导致交叉感染，危害人体健康。 因此，环卫部门已开始限制直接将餐饮垃圾用作畜禽饲料。 餐饮垃圾中动植物油脂含量高，许多不法经营者从中简单分离出潲水油， 用来制造假冒伪劣的工业产品，例如油漆等来谋取暴利。更有甚者，有人在宾 馆、饭店的浴水池或排污口中掏取“地沟油”，用土法炼制成所谓的“精制食用 油”再兜售给街头的小商贩或某些食品加工厂，炸油条、做饼干等，严重危害 人民群众的身体健康 闫亚娟，2007 。 因此，城市餐饮业废弃油脂的处理问题已经是一个刻不容缓的问题，如不 及时处理，将会导致严重的后果。 1(2餐饮废弃油脂处理研究现状 4 第l章绪论 国内外餐饮废弃油脂处理主要采用物理法、化学处理法和生物处理法。物 理方法主要有磁吸附分离法、粗粒化法、气浮法、超声波法。化学方法主要有 化学絮凝法、化学氧化法。 1(2(1餐饮废弃油脂物理处理方法 “磁吸附分离法"处理餐饮废水的工艺是借助于磁性物质作载体，利用油 珠的磁化效应，将磁性颗粒与含油废水相混和，使油分在磁性颗粒上粘附，然 后再通过磁性分离装置，将磁性物质及其吸附的油留在磁场，从而达到与水分 离的目的 曾胜等，1999 。粗粒化技术根据粗粒化滤料具有亲油疏水的性质 设 计的，本法用于预处理乳化油。用W型和H型改性聚丙烯酞胺纤维作为粗粒 化滤料，均能有效处理乳化油脂废水，某些指标显示H型比W型具有更好的 除油性能。它能有效降低餐饮废水的含油量，并能大幅度降低CODer，的浓度， 采用此法作为餐饮废水的预处理方法，将有利于后续的生化处理 刘蓉等， 2001 。气浮法是使大量微细气泡吸附在欲去除的颗粒 油滴 上，利用气体本身 的浮力将污染物带出水面，达到分离目的的方法。目前该法己广泛应用于食品 1996 。超声波在水中可以发生凝聚效应、空穴或空化效应。当超声波通过含油 污水的溶液时，造成微小油滴与水一起振动。但由于大小不同的粒子具有不 同 的相对振动速度，油滴将会相互碰撞、粘合，使油滴的体积增大。随后，由于 粒子已变大不能随声波振动，只作无规则运动。最后水中小油滴凝聚并上浮， 油水分离效果良好。超声波处理乳化油污水必须先通过实验，以确定最佳的声 波频率，否则可能出现超声粉碎效应，影响处理效果 Latham，2005;See，2007 。 1(2(2餐饮废弃油脂化学处理方法 王乃之等 2000 采用复合型混凝剂，将餐饮废水经过混凝沉淀、砂滤以 及活性炭吸附深度处理后，达到国家二级排放标准 GB8978(1996 ，经消毒处理 可用于，,活杂用水。尹艳华等 2002 研究表明硫酸铝钾+聚丙烯酞胺作絮凝剂， 可明湿降低餐饮废水的CODer及其浊度，CODer的去除率可达到83(3,，浊度 去除率可达到76(9,(化学氧化法一般是在催化剂作用下，』1j化学试剂如:臭氧、 Fenton试剂等处理有机废水以提高其可生化性或直接氧化降解废水中的有机物 5 华南师范大学硕士学位论文 的去除能力较低，而且投资大，占地广， 流程 快递问题件怎么处理流程河南自建厂房流程下载关于规范招聘需求审批流程制作流程表下载邮件下载流程设计 复杂又需要特殊设备，其结果大 都是对污染物的稀释、聚集或在不同环境中的迁移，还有产生二次污染的可能， 在实际应用中通常需要配以生物处理技术。选用经济合理、快速有效的处理方 法降解转化高浓度油脂废水，解决水环境污染问题，已成为国内外环境保护的 重中之重 胡玉洁等，2004 。 1(2(3餐饮废水的后续处理 油水分离后排出的液态泔水可用于提炼泔水油，虽然泔水油具有很高的利 用价值，但泔水精制后仍然是动植物油的混合体，其理想的用途是用作燃料。 经过研究和试验，精制泔水油以适当的比例与轻质柴油混合及配制处理，成为 et eta1(，2004: 一种新型的混合燃料，即生物柴油 Laraa1(，2004:Dmytryshyn Knotheet el a1(，2005;Suehara a1(，2005 。据统计，每吨餐厨垃圾可以提炼出 20-80埏废油脂，经过集中加工处理制成生物柴油。 预处理和酯交换，以及脂肪酸甲酯和甘油回收构成餐厨垃圾生产生物柴 油 工艺流程的主要阶段。而预处理包括沉淀除杂、酸化脱胶、水蒸气蒸煮脱臭、 谢炜平，2008 。 真空脱水等 图1(1生物柴油的工艺流程 The flowofbiodiesel Fig(1-1process 这种柴油互溶性、均匀性好，经较长时期的存放不分层，不产生沉淀物， 而且现有的发动机使用生物柴油既不必改动也不必另外添加附属设备，同时生 物柴油可再， 三，可生物降解，具有防止空气质量恶化与地球温室效应的优点。 我困柴油、汽油等液体燃料十分紧缺，用泔水油作燃料为我幽以后寻找替代燃 料提供了一条新的途径。此外，泔水油除了可作燃料，还可以经高温、高压、 水解、中和、过滤、真空、蒸馏、脱色、脱臭、分离、脱水、加氯等一系列处 6 第1章绪论 微生物，特别是真菌对脂肪酸的分解过程基本上与动植物分解脂肪酸的方 式相同，也是经过13(氧化途径。降解的关键步骤是底物被氧化酶氧化的过程， 此过程需要氧分子的参与，首先将分子氧结合到基质中，形成含氧中间体，然 后再转化成其他物质。一般认为，微生物的降解酶类属于诱导酶，通常在碳、 氮源受限的情况下才表达。降解效率在很大程度上取决于降解酶系的产生及其 催化活性的增强。油脂降解微生物本身可能含有可降解油脂的酶系的基因或存 在降解质粒，一旦受到油脂的诱导有关基因就表达出相应的降解酶系。70 年代 以来，发现了许多具有特殊降解能力的细菌，这些细菌的降解能力由质粒控制。 到目前为止，已发现自然界微生物中所含的降解性质粒多达30余种。Yen 等 NAHT 。因此如何筛选、培养高效降解油脂菌株的研究已逐渐成为国内科研人 员关注的焦点。当前对于餐饮废水进行生物降解的微生物的筛选多从自然界或 工业生产中选择和培养符合要求的菌种，以提高餐饮废水生物处理的效率。实 验证明，利用活性污泥驯化方法难以培养出降解油脂的高效菌株，丽门前最有 效的方法是在实验室中对具有降解油脂能力的微生物菌株进行再分离、筛选， 进一步筛选出降解能力强的高效菌株，然后快速培育增殖以便进行工业应J j Ericaetal(，20lo 。生物法与物理或化学方法相比较具有成本低，投资小，效率 高，无二次污染等特点。因此筛选高效菌株对油脂废水进行生物处理几疑是提 7 华南师范大学硕士学位论文 et 高废水处理效率的有效途径 Morilloa1(，2009;Sridhar,2009 。 1(2(4(1具有降解废油脂能力的细菌 赖万东等 2000 从油脂加工厂废水的活性污泥中筛选出两株具有降解废油 脂的菌株，经鉴定为芽孢杆菌属 Bacillus xylosoxidasss 。试验结果表明，混菌对油脂的最适降解条件为pH:5(5(7(0， 温度:25(35?、溶氧值5(5-7(0 000 g,L之间，当油含量E(oil?2mg,L时， 混菌能有效地降解废水中的油脂成分，投菌时间HRT 24h后，除油率最高可达 到99(6,左右，几乎完全降解;当油含量E(oil 2 000mg,L以上，油脂浓度 对微生物的活性产生抑制作用，生化反应为基质控制步骤，反应速率随水中油 脂浓度的增高而降低。当油含量E(oil在O(2 000mg,L范围内，油脂降解过程 是一级反应。但降解速率常数随初始油含量的增大而逐渐减小。 徐保成等 2006 从油脂加工厂污水道和餐饮业下水道污水中驯化分离筛选 出三株实验菌株，经鉴定为分别门多萨假单胞菌 X1 、假产碱假单胞菌 C2 和 洋葱伯克霍尔德菌 LX 。通过对三株油脂降解菌的比较，挑选出一株有较强油脂 降解能力的洋葱伯克霍尔德氏菌 Burkholderiacepacia ，对其降解工艺条 件进行 优化研究。结果表明，在优化的油脂降解条件下 pH值7(0，30。C，溶解氧3(0mg,L ， 处理初始油脂浓度为1000mg,L废水，24h后其油脂降解率达到90,以上，COD去 除达到92,。研究发现，洋葱伯克霍尔德菌能在降解利用油脂的同时还分泌出 一定量的胞外脂肪酶，同时通过所产生的脂肪酶等降解酶系作用于油脂，将其分 解氧化为低级脂肪酸、甘油、醇类等低分子有机物，最后降解为H20，C02等代谢 产物。 秦华明等 2007 也从长期受油污染的土壤中分离筛选得到能高效降解 油脂 Burkholderia ? cepaciaX4菌株。该菌株降解油脂的最适温度和pH分别为30和 7(0，菌株降解油脂时适宜的氮源为硫酸铵，适宜碳氮比为4:l。共基质碳源的添 加有利于生物量的迅速增加和油脂降解率的提高，添加适量的葡萄糖能使油脂 降解率提高8,(10,。50mg,LCa2+对菌株生长和油脂降解更有利。在橄榄油浓 度高达209,L条件下最大油脂降解率仍可达83,。在油脂浓度?2500mg,L时， 该菌对油脂的降解符合抑制动力学Monod方程。 张万祥等 2007 从含油脂废水中取样，通过分离、培养，筛选出以油脂为 唯一碳源和能源并能分解油脂的菌株，对其基因组16SDNA测序，在核酸数 据 8 第l章绪论 库中进行BLAST比对，并进行生化反应，鉴定为栗褐芽胞杆菌，为下一步实 验证实其分解油脂的作用和机制奠定了基础。 1(2(4(2具有降解废油脂能力的真菌 毛霉中有些种类在转化外源性脂肪酸时能在细胞中积累Y-亚麻酸 汪云岗 等，1999 。利用毛霉既能去除废水中的油脂，又能从废水处理的菌体中提取具 生物学活性的类脂，这是综合解决油脂废水污染的一种好技术。李垄宝等 2002 为基质培养，实验结果表明所用毛霉的4个菌种都能不同程度地降解油脂。其 中M(racemosus经5d培养，油脂的去除率最高，达92,，菌体内Y(亚麻 酸含 量为13(5mg,g，以不同浓度油脂废水研究毛霉M(racemosus对油脂的降解和 菌体生长情况表明，在59,L油脂浓度下，经3d培养，该茵体生物量达最大值 3(69,L，此时油脂去除率达92,。在209,L油脂浓度下，经7d培养，达最 大生物量169,L，对油脂的去除率为90,。当到达最大生物量时，菌体类脂和 ,L 16(8mg,g 。 tipotytica 对色拉油废水 吴兰等 2003 研究发现解脂耶氏酵母 Yarrowia 具有降解能力，应用正交实验筛选最佳实验条件，再按正交实验结果进行单因 素实验研究各因素分别对降解作用的影响，研究结果表明该菌在pH6―7、 温度 000 (30?、摇床转速200r,min、废水中油脂起始浓度?2mgm的条件下， 为25 对废水中的色拉油具有较高的降解率，最高可达95(59,。 胡玉洁等 2004 从城市污水处理厂的活性污泥中分离筛选的优良油脂分 解菌――假丝酵母，命名为WZFF(G(284，对于高含油废水具有很强的适应能 力。在以高浓度食用色拉油作为唯一碳源、添加适当无机盐的废水处理体系中， 该菌株的细胞代谢速度快(生长繁殖旺盛;除菌体细胞本身显示出明显的乳化 能力之外，还可通过产生大量的生物表面活性物质提高乳化力，将大量的高浓 度油脂迅速乳化，形成均质的完全乳化状态，显示了高强乳化作用效果，促进 了油脂的快速分解。同时该菌株生产、分泌出高活性脂肪酶，可以将油脂快速 分解、转化。 微生物是一类现实和潜在用途都很大的生物资源，人类对微生物的利用经历 过天然混合培养到纯种培养两个阶段，分离纯培养技术的发明和应用是微生物学 9 华南师范大学硕士学位论文 发展的一个巨大进步。但是，在长期的实验和生产实践中，人们也不断地发现很多 生物过程是单株微生物不能完成或只能微弱地进行，必须依靠两种或两种以上的 微生物共同培养完成。 冯树等，1990 随着纯培养技术的完善和对微生物间互生 culture 或混合发酵 和共生现象的研究，人为的，自觉的微生物混合培养 Mixed Mixedfermentation 已渐为人们所重视。对混合菌资源的研究，不仅具有深远的 理论意义，更具有重大的应用价值。 混合微生物培养法是处理废水的最有效、最具前途的方法，因为废水大都含 有多种复杂成分，利用混合菌培养不仅可以同时消除几种污染物，而且对某些污 染化合物来说，单一菌种不能降解而需混合菌的协同作用。这方面的研究已取得 一些成果。 李伟光等 2003 从哈尔滨炼油厂含油废水处理站曝气池的活性污泥中筛 选出39株除油工程菌，通过研究pH、温度、溶解氧 DO 、培养时间、油浓 度以 及营养盐等环境因素对单株菌、双株菌、多株菌和全混合菌除油效果的影响，确 定出最佳运行条件。试验结果表明，在营养充分，pH为7(O，温度为30。C，油浓度低 于100 L的条件下，各组菌除油效率均达到各自的最高值，但全混合菌除油的 meg 效果明显优于其它各组菌，其微生物的共代谢作用对含油废水的降解更为充分和 彻底。 混合菌的耐受力最强，各菌株的共代谢作用提高了混合菌对环境的适应力。 通过调节混合茵比例、pH、温度及溶氧量等因素，可使混合菌达较适的生态状态， 发挥较高的生产效能。虽然混合菌在很多领域中的作用己得到充分肯定，部 分成 果已成功应用于实效的理论指导，而且对于已经应用的混合菌体系也不能有效地 协调菌问的关系，使其达最佳生态状态，发挥最大效应。这严重地阻碍了混 合菌培 养的发展和应用。在现有的基础上对混合菌菌间关系和协同作用机制从生理、 代谢和遗传角度进行深入研究，对混合菌资源的理论和应用都将有巨大突破。 随着混合菌资源在各方面应用研究的深入，人们不再满足于传统的反应模式， 已开始引入一些新兴的生物工程技术，使该领域的研究更有活力。采用固定化细 胞技术固定混合菌可使反应系统多次使用，降低成本，增加效率，在实际应用中很 有意义。利用细胞融合技术和基因一【程技术由具有互生或共，上关系的微生物研 制工程菌，使工程菌具有混合菌培养的功能并拥有纯培养菌营养要求单一、生理 ，是极有前途的研究方向。 代谢稳定易于调控等优J?i 目前，生物法在处理油脂废水中只是作为:二级或三级处理工艺。但从长远、 10 第1章绪论 根本意义来看，应采用生物法进行彻底治理。可以说生物法是解决环境污染问 题的一种最有效、最安全和最合理的方法。因为只有微生物才是地球生态系统 最重要的分解者，也是开发潜力最大、人类最宝贵的资源库。 1(3研究 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 和内容 本课题提出餐厨垃圾废弃油脂处理产业化新模式，即把废弃油脂用物理方 法部分去除后的餐厨垃圾加工成干粉运到农村，利用油脂降解菌分解干粉中剩 余的废弃油脂，制成用于蚯蚓养殖的饲料，再集中收购蚯蚓，工厂化生产蚓激 酶和高蛋白饲料等形成产业链，资源得到循环利用。 本试验分析餐厨垃圾粗脂肪含量，筛选高效油脂降解菌，优化油脂降解条 件，运用油脂降解菌降解餐饮垃圾干粉中废弃油脂，使餐饮垃圾干粉成为蚯蚓 养殖培养基，并且使餐厨垃圾得到无害化和资源化的处理。 技术路线 理化条 件优化 第二章油脂降解菌的筛选 第二章油脂降解菌的筛选 (1材料和方法 2 2(1(1实验材料 2(1(1(1主要仪器: 名 称 型 号 生产厂家 生化培养箱 上海智城分析仪器制造有限公司 高压蒸汽灭菌锅 THA(3560CAutoclave 超净工作台 SW二CJ(1CU 苏州安泰空气技术有限公司 台式恒温摇床 TH2(D 台式低速离心机 L(550 长沙湘仪离心机仪器有限公司 分析天平 AcculabALC 赛多利斯科学仪器有限公司 通风柜 M(TFG(A 深圳美加丽实验装备有限公司 电热鼓风干燥箱 101A(2 上海荣丰科学仪器有限公司 光学显微镜 Z―100 Eclipse 电热恒温水浴锅 SHS(4 黄石市恒丰医疗器械有限公司 定时加热磁力搅拌器 JB一2 金坛市荣华仪器制造有限公司 电炉 ES(032 分光光度计 4000U 移液枪 Eppendorf 2(1(1(2主要药品试剂: 药品名称 生产厂家 蛋白胨 北京双旋微生物培养基制品厂 葡萄糖 上海伯奥，1i物科技有限公司 蔗糖 J'(州化学试剂厂 13 华南师范大学硕士学位论文 牛肉浸膏 北京双旋微生物培养基制品厂 酵母粉 北京鼎国生物技术有限 责任 安全质量包保责任状安全管理目标责任状8安全事故责任追究制幼儿园安全责任状占有损害赔偿请求权 公司 琼脂 广州威佳科技有限公司 花生油 益海 广州 粮油有限公司 芝麻油 上海太太乐食品有限公司 猪油 市场购买，炼制 硫酸 广州化学试剂厂 石油醚 广州市云荟贸易有限公司 Tween(80 北京鼎国生物技术有限责任公司 广州化学试剂厂 硫酸铵 氯化钠 天津广成化学试剂有限公司 磷酸氢二钾 广州化学试剂厂 碳酸钙 广州化学试剂厂 柱层层析硅胶 青岛海洋化工厂 氧化铝 层析 上海五四化学试剂有限公司 甘油 广州威佳科技有限公司 2(1(1(3实验样品来源: 取华南师范大学南门垃圾场土样和学生第一食堂下水道水样，4?保存。 2(1(1(4主要培养基: 细菌基础培养基 g,L :牛肉膏一蛋白胨培养基。牛肉膏3(0，蛋白 胨10(0， NaCI 5(0，pH7(2―7(4。 霉菌基础培养基 g,L :马铃薯一蔗糖培养基。马铃薯200(0，蔗糖20(0， pH6(0-7(0。 酵母菌基础培养基 g,L :酵母粉(蛋白胨(葡萄糖 YPD 培养基。酵母粉5(O， 蛋白胨10(0，葡萄糖20(0，琼脂20(0，pH4(0(5(0。 5(0，K2fIP042(0，Nail2P04 富集驯化培养基 g,L :酵母膏1(0， NI-14 2S04 2(O，花生油20(0，pH7(0 一 2(0，NaCI 5(0，KEHP042(0，NaH2P04 2(0，花 驯化培养基 g,L : NI-h 2S04 (0，pH7(0。 生油20 14 第二章油脂降解菌的筛选 5(0，CaCI(7H20 初筛培养基 g,L :蛋白胨10(0，NaCI 0(1， 琼脂9(0，pH7(4， 终浓度为l,，制成平板。 2(0， 2(0，Nail2P04 复筛培养基 g,L :花生油0(5， 'NH4 2S045(0，K2HP04 NaCI 2(0，pH7(O。 细菌保藏培养基:基础培养基+20(09,L琼脂，分装入试管灭菌，制成斜面。 霉菌保藏培养基:马铃薯(蔗糖培养基+20(09,L琼脂 PDA ，分装入试管灭 菌，制成斜面。 酵母保藏培养基:酵母粉(蛋白胨(葡萄糖 YPD 培养基+20(09,L琼脂，分装 入试管灭菌，制成斜面。 本研究中，培养基除特别注明外，均采用121?蒸汽灭菌30min。 2(1(2实验方法 2(1(2(1菌种分离筛选方法 驯化:用500mL无菌广口瓶采样，将样品置于4?冰箱中保存备用，富集 培养前取一定量的样品，注入盛有玻璃珠的无菌三角瓶中震荡lh，打碎菌 胶团， 释放游离菌。将垃圾场土样制成菌液，分别取菌液和下水道水样各5ml加入到 液体驯化培养基中，32?、180r,min恒温振荡培养。每天观察。每7d转接10ml 培养物至30 ml新的培养基中。此驯化过程持续2个月。 初筛:取驯化培养菌液lml点种到初筛培养基平板上，32?恒温培养48h， 测量菌落周围水解圈的直径，以此判断待测菌株对油脂的分解能力。 复筛:采用摇瓶降解实验进行复筛。将初筛入选的菌株接种到复筛摇瓶培 养基中 花生油为唯一碳源 ，置于摇床中，180r,min，32。C培养48h后测定含 油量的变化，以待测菌株对油脂的分解率作为入选菌株的判断依据。 2(1(2(2菌种分离纯化 菌种分离:将复筛入选的菌株分别接入细菌、酵母和霉菌液体基础培养基 振荡培养。整个液体培养置于32。C，180r,min的恒温摇床上进行。2(3d后接种 至对应的固体培养基中进行涂布平板分离与平板划线法分离。将纯化后的菌落 接种至斜面保藏培养基上保存。 华南师范人学硕士学位论文 细胞及菌落形态观察:将活化后的菌株接种于固体及液体培养基，30?培 养72h，观察液体培养基中有无沉淀、菌岛、菌环、菌醭以及固体平板上菌落 的形态特征:大小、形状、表面 光滑、粗糙等 、隆起 凸、凹、平 、边缘 锯齿 状、波浪状、纤维状 、硬度、透明度等。大小的测定:取培养24h的斜面 培养物， 涂片，染色，在显微镜下用校正好的目镜测微尺测出菌体的长和宽，并求其平 均值。 2(1(2(3菌种保存方法 1 低温保藏:取相同规格的试管，每支试管中均盛入10ml相应的基础培 养基，塞紧棉塞后，121?高温灭菌20min后制斜面培养基，待培养基冷却后， 无菌操作台内，接种环挑起适量的菌株接入斜面培养基上，每种菌接3支管， 32?恒温培养36h，选取发育较好的试管菌种放入4。C左右的冰箱中保存，每月 传代一次。 2 超低温保藏:菌株接入液体培养基中，32。C培养36h，离心后加入无菌 新鲜培养基和甘油，甘油浓度为10(20,，(70?((80?条件下超低温冷 冻保藏。 2„124种子培养 将一环菌苔 32。C培养24(36h的斜面种子 接种于装有50mL种子培 养基的 三角瓶，32?、180r,min条件下培养36h 己注明的除外 。 2(1(2(5摇瓶培养 et 250mL三角瓶中装培养基50mL，以6,接种量 Boucheza1(，2002 接入 种子液，32?、180r,min条件下培养。 2(1(2(6花生油标准曲线 1(石油醚的纯化:于色层分析柱 50X600mm 中塞一团干脱脂棉花于活 析用中性氧化铝。使石油醚通过制备的吸附柱，集取柱滤液。 2(花生油最大吸收峰值的测定:准确称取29花生油溶于石油醚中，定 容 50ml，分取适量注入石英比色皿中，测定在210(250nm范围内的吸光度。发现在 波长212nm处有最大吸收值。 16 第二章油脂降解菌的筛选 3(花生油标准曲线:取7(9个50mL的容量瓶，以花生油为溶质，以石油醚为溶 剂。准确地配制浓度依次为O(0、4(0、8(0、12(0、16(0、20(0、24(0、 处，用lcm石英比色皿，以石油醚为空白，依次测定上述系列样品的吸光度。重复七 次，取其平均值。以油浓度为横坐标，以0D212为纵坐标，作出标准曲线。在后面 的实验中，利用标准曲线可以通过测定OD212光吸收值来计算样品中含油量。 2(1(2(7油脂含量的测定 采用紫外分光光度法 沈叔平，汪小梅，1994 。具体步骤如下: 1(萃取:取不同时间段的液体培养样品，加50,硫酸铵溶液去除蛋白 质后 用4000 r,min速度离心10min，上清液移入分液漏斗中，加1+1硫酸5ml酸化。 用10ml石油醚清洗三角烧瓶后，移入分液漏斗，并充分振荡3min，静置使之 分层，将水层移入采样瓶中，将石油醚移入50ml离心管里，再将水层移回分液 漏斗内，用10ml石油醚重复萃取一次，静置分层后将石油醚层移入离心管，与 第一次萃取液混合，将离心管定容至50ml。 2(测定:在波长212nm条件下中测定吸光度，利用标准曲线计算出油脂浓 度。 2(2结果与讨论 2(2(1菌种筛选结果 2„211初筛结果 富集及驯化培养的主要目的是使目标菌株能够适应其生长环境并旺盛生 长，其它的微生物呈现弱生长或不生长，本实验将采集的样品置于含油培养基 中，使不适于含油培养基的菌株被淘汰掉，而能适应的菌株被保留下来。通过 富集培养和驯化培养，使适合含油培养基的微生物大量扩增。本研究是从学校 餐厅下水道口南门垃圾场采集6个样品，经富集、好氧驯化培养后的培养液稀 释分离得到的菌株63株，首先在初筛培养基平板上进行油脂分解试验，根 据产 生晕圈的大小作为初筛的依据，部分菌株的初筛结果见表2(1。根据初筛的结果， 排除生长不很旺盛的，共筛出有较强分解能力的菌株18株。 17 华南师范大学硕士学位论文 表2(1油脂分解菌的初筛结果 Table2????1Thefirstresult strains ofscreeninggrease―decomposing 水解圈直径 mm 编号 重复l 重复2 重复3 平均值 mm M(1 17(O 17(2 16(9 17(0 M(5 17(9 17(5 18(4 17(9 M(7 16(7 17(3 17(2 17(1 M(8 15(9 16(1 16(3 16(1 M(12 16(9 16(3 17(1 16(8 M(14 17(1 15(5 16(3 16(3 M(26 19(2 18(7 19(4 19(1 M(28 16(8 17(5 17(4 17(2 M(3l 17(0 16(5 17(1 16(9 M(34 15(7 16(2 16(0 15(9 M(35 16(3 17(1 16(9 16(7 M(42 17(1 17(4 17(2 17(2 M(47 17(2 17(0 17(4 17(2 M(49 16(5 17(2 16(8 16(8 M(51 17(3 17(5 18(0 17(6 M一54 17(0 17(2 16(5 16(9 M(59 16(9 16(5 17(4 16(9 M(62 17(3 17(4 16(9 17(2 2„212复筛结果 根据配制不同浓度的花生油石油醚溶液，得到相应的吸光度，以花生油浓 度为横坐标，以吸光度为纵坐标，作花生油标准曲线。为准确反映样品浓度与 吸光度之间的关系，我们朋“最小二乘法’’对实验数据进行回归，这样可以得出一 条对各数据点的误差最小、最精确的工作曲线，从而使测定结果更接近真实值。 计算出回归方程的;:j数b 0(0048和常数项a (0(0009建立了回归方程: Y a+bx 0(0048x(0(0009，作出了工作曲线见图2(1 第二章油脂降解菌的筛选 O(12 0(1 三0(08 N ;0(06 型 米0(04 螫 0(02 O O 8 12 16 20 油浓度 鸭,L 图2(1(花生油标准曲线 Standardcurveof oil Fig(2-1 peanut 本研究主要通过测量菌液中剩余油脂的含量来衡量该菌降解油脂的效 果。 nnl 将培养液离心后用石油醚将其中的油脂萃取出来，稀释到一定浓度后在212 波长下采用紫外分光光度法测量样品的吸光值。然后由标准曲线求得油脂含 量。 通过初筛共得到18株产脂肪酶能力高的油脂降解菌，将这18株菌等量 制 80 成混合菌液编号M以及18种单菌分别接种于复筛培养液于32?，1r,min的 am 摇床上培养72h，采用萃取法将剩余油脂从培养液中萃取出来后在波长212 处测量其吸光度，利用标准曲线计算出油脂浓度。根据发酵前后培养基中油含 量的变化，得到降解油脂效率高的菌株。油脂降解率的计算公式:降解率彳初始 油含量(残余油含量 ,初始油含量乖100,。复筛结果见表2(2。 表2-2油脂分解菌的复筛结果 Table2―2Thefirst of strains repeatedscreening黟e雏e―decomposing 分解率 , 编号 重复l 重复2 重复3 平均值 , M 78(3 76(5 80(1 3 78( M(1 32(4 34(1 35(6 34(0 M(5 38(9 37(6 39(5 38(7 M(7 36(9 34(7 34(2 35(3 M(8 35(6 31(4 29(5 32(2 M(12 35(0 32(8 36(6 34(8 M(14 34(5 32(1 30(7 32(4 19 华南师范大学硕士学位论文 M(26 40(3 42(O 39(5 8 40( M(28 34(7 35(6 33(6 34(8 M(31 37(6 34(2 31(8 34(5 M(34 19(5 20(8 22(4 20(9 M(35 32(8 33(6 35(2 33(9 M(42 36(9 35(5 34(5 35(6 M(47 33(8 35(6 37(4 35(6 M(49 31(6 32(8 36(9 33(8 M(5l 35(6 38(4 37(5 37(2 M(54 30(7 32(8 37(6 33(7 M(59 32(4 36(9 31(7 33(6 M(62 33(5 36(1 35(6 34(1 2(2(2菌种分离纯化结果 对复筛得到的菌株进行形态特征鉴定进行分离纯化，获得了三大类高 效油 脂降解菌:6株细菌、5株霉菌和7株酵母菌，它们均能在以花生油为唯一 碳源 的培养基中较好生长。给这18株菌分别编号，通过菌种细胞及菌落形态观 察和 显微镜并显微镜下用校正好的目镜测微尺测出菌体大小，见表2(3，2(4， 2(5( 表2(3筛选出的细菌在基础培养基上的特征 Table2―3Charaeteristiesofscreened baeteriaonb? terialculturemedium plate 编号 菌落特征 细胞形态 细胞大小 Xl 圆形、白色、湿润、中间微凸 细短杆状 0(3(1(1um X2 圆形、乳白色、较干燥、凸起 杆状 O(7(1(5um X3 圆形、深红色、湿润 细短杆状 O(2(1(1um X4 表面湿润，光滑，厚，边缘整齐 杆状，单个或 成对排列 0(7(2(5um X5 圆形、亮黄色、较湿润、中间凹 杆状 0(6(1(2um 陷，边缘锯齿状 X6 表面湿润、薄、中间略突起 杆状 O(2(1(Oum 第二章油脂降解菌的筛选 表2(4筛选出的霉菌在PDA培养基上的特征 Table2-4Characteristiesofsereened culturemedium hingusonPDA plate 编号 菌落特征 菌丝形态