分子生物学课程

《分子生物学课程》 教案 中职数学基础模块教案 下载北师大版¥1.2次方程的根与系数的关系的教案关于坚持的教案初中数学教案下载电子教案下载 2007～２008学年第　1学期授课专业：生物技术　　课程名称：　分子生物学主讲教师:　何宁佳　　　查幸福　赵爱春　ﻬ课　程　 说明 关于失联党员情况说明岗位说明总经理岗位说明书会计岗位说明书行政主管岗位说明书 一、课程名称：分子生物学二、总课时数:45三、先修课程：基因工程原理四、使用教材:PC　Ｔｕｒｎｅr,　AＧMｃLennａn,ADBａtes&MＲＨWhｉte,《Instaｎtnotes　iｎ　Ｍoleculaｒ　Bｉolｏgy》,科学出版社,2004年1月第八次印刷五、教学参考书：1　ＰＣ特纳、AG麦克伦南、AD贝茨、MRH怀特,《分子生物学-现代生物学精要速览中文版》，科学出版社，2004年8月第七次印刷。2　朱玉贤，　李毅编著《现代分子生物学》，第二版，高等教育出版社，2004年1月第3次印刷。六、考核方式:理论课采用闭卷考试的方法,总成绩,平时成绩30%,中期考试10%，期末考试6０%七、教案编写说明:教案又称课时授课 计划 项目进度计划表范例计划下载计划下载计划下载课程教学计划下载 ,是任课教师的教学实施 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 。任课教师应遵循专业教学计划制订的培养目标,以教学大纲为依据,在熟悉教材、了解学生的基础上,结合教学实践经验，提前编写设计好每门课程每个章、节或主题的全部教学活动。教案可以按每堂课（指同一主题连续1~２节课）设计编写。教案编写说明如下:1、编号:按施教的顺序标明序号。2、教学课型表示所授课程的类型,请在相应课型栏内选择打“√”。3、题目：标明章、节或主题。4、教学内容：是授课的核心。将授课的内容按逻辑层次,有序设计编排，必要时标以“＊”、“＃”“？”符号分别表示重点、难点或疑点。5、教学方式既教学方法，如讲授、讨论、示教、指导等。教学手段指教科书、板书、多媒体、模型、标本、挂图、音像等教学工具。6、讨论、思考题和作业:提出若干问题以供讨论,或作为课后复习时思考,亦可要求学生作为作业来完成,以供考核之用。7、参考书目：列出参考书籍、有关资料。8、日期的填写系指本堂课授课的时间。ﻬ课　时　　教　案讲授人查幸福课　时１.5序　号1课题内容Cｅllsａndｍａｃrｏmｏlecules教学时间2０0７.09.03教学方法讲授教学课型理论□实验□　　 习题 有理数乘除混合运算习题护理管理学习题以及答案高等数学极限习题过敏性休克习题与答案诫子书习题及答案 □实践□　　复习□其它□教学手段板书、多媒体教学目的1.了解原核细胞和真核细胞结构、亚细胞及分子组成上的差异2.了解真核细胞亚细胞器的结构与功能３.掌握细胞和大分子的分类，及用以分析的一些方法重点难点细胞分类、亚细胞器教　学　内　容备　注Ａ1Cellｕlaｒcｌasｓificatiｏn　（细胞分类)Eubacterｉa(真细菌)和Ａｒchaea(古细菌)属原核细胞生物,它们一般由cellｗall（细胞壁）、ｐｌａsmamｅmbrane(细胞膜)、cｙtｏplａsm(细胞质)和nｕcleｏiｄ(类核体)构成，细胞中有质粒、核糖核酸、核糖体及各种蛋白质，没有亚细胞器。古细菌虽然在结构上与真细菌相似，但是其复制、转录和翻译更接近真核生物。Ｅukａryoｔｅs(真核生物）包括动物、植物、真菌和原生生物（藻类和原生动物)，其细胞体积较大，细胞质中含有细胞器、核糖体和由蛋白质纤维组成的细胞骨架，细胞核由膜包绕。植物、许多真菌和原生生物也有细胞壁。真核生物大多是多细胞,在发育过程中不同群细胞经分化形成特定组织。A2Suｂｃellulａｒ　orgａｎellｓ（亚细胞器)Nｕｃlｅｉ(细胞核）携带细胞的遗传信息,每条染色体含有一个DNＡ分子。有核膜包围，内有核仁,核仁是rＲNA合成和核糖体进行部分组装的场所。Mｉtochondriaanｄchｌｏroplａsts(线粒体与叶绿体)线粒体是细胞产能的场所,由外膜和内膜组成，内膜突出折叠成嵴,其内含有一个小的环状ＤＮＡ分子、特异RNA和核糖体,可合成小部分线粒体蛋白，其所需要的大部分蛋白质则由细胞核ＤNA编码并在细胞质中合成。植物的叶绿体是光合作用的场所,依靠光同化ＣO2　与水形成碳水化合物和氧气。叶绿体在内膜腔内有类囊体,类囊体上含有捕捉光能进行光合作用的叶绿素。叶绿体也能独立合成小部分蛋白质。Endoplasｍｉｃrｅtiｃuluｍ(内质网）　是细胞质内与核膜相连的膜体系,光面内质网主要合成脂类及用于氧化解毒的酶。粗面内质网上有许多核糖体,特异合成分泌性蛋白质，经过初步的糖基化修饰，转运至高尔基体进一步修饰分检并分泌。Micｒoｂｏdiｅｓ　(微体)溶酶体有膜包绕，从高尔基体出芽而成，含有丰富的消化酶,回收来自损伤细胞器或体外进入的大分子。过氧化物酶体含有破坏过氧化氢的酶，可防止过氧化氢和高活性自由基损伤细胞。乙醛酸循环体是特定的植物过氧化物酶体，进行乙醛酸循环。它们合称微体。Oｒganelｌeｉsｏlation（细胞器的分离)大小和密度不同的细胞器,根据不同的沉降系数值采用差速离心法相互分离，并用密度梯度离心进一步纯化。A3Ｍaｃromolecuｌeｓ　（生物大分子)Proｔｅinandnucｌｅｉcaｃid(蛋白质和核酸)蛋白质是氨基酸以肽键连接而成的聚合体，它是体内重要的结构物质和功能物质。核酸（ＤNA和RNＡ）是核苷酸以3／，5/-磷酸二酯键连接形成的聚合体,由含氮碱基、五碳糖和磷酸组成。核酸参与遗传信息的储存与加工，但这些信息的表达则需要蛋白质。Ｐoｌysacchariｄｅｓａndｌipiｄｓ(多糖和脂类)也是重要的生物大分子。Ｃｏｍpleｘmacroｍoｌecｕles(复杂大分子)核蛋白是核酸与蛋白质的结合体,如端粒酶，核糖核酸酶P等。另外还有糖蛋白、蛋白多糖、脂蛋白和糖脂。A４　Larｇemacｒomoｌeｃularaｓsemblｉeｓ(大分子的组装)Ｐroteincoｍplｅxeｓ　(蛋白质复合体）　细胞中多个构件和运动元件是由蛋白质复合体构成的。细胞骨架就是由微丝（肌动蛋白和肌球蛋白）、微管（微管蛋白)和中间纤维等多种蛋白质构成。微丝组构细胞形态、控制细胞运动及亚细胞器在细胞内的分布。微管是细胞骨架、真核生物纤毛、鞭毛及表面毛状结构的主要组分。肌动蛋白和肌球蛋白也是肌肉纤维的主要组分。Nucleoprotein　(核蛋白)　由核酸与蛋白质组成。核糖体是较大的细胞质核糖核酸蛋白质复合体，是蛋白质的合成场所。细菌7０S核糖体含有大亚基（５0S）和小亚基(30S）,50S亚基包含２３Ｓ、5SＲNA分子和31种蛋白质,30S亚基包含16SRNA分子和２１种蛋白质。真核生物的8０S核糖体含有６0S(包括２8S、５.8S和多种5SRNA）和４0S（含18SRNA）两个亚基。染色质是构成真核生物染色体的元件,由DＮA与组蛋白组成的脱氧核蛋白复合体。病毒是核蛋白复合体的另一个例子。Membraｎes(膜）　脂质双层分子与蛋白质构成细胞与细胞器的边界。外围膜蛋白结合在膜的外表或锚定在膜上。镶嵌膜蛋白被埋在膜中,跨膜蛋白横跨双层膜,突出膜的内外表面。膜蛋白有多种功能（参见教材P13)思考题与作　业1.真核生物与原核生物的细胞结构的差异有哪些？2．细胞中各个亚细胞器分别行使什么功能?教学后记学生对这些知识点都容易接受,但对专业术语的英文不熟悉。在以后的教学中要经常提及,让学生熟悉这些专业英语。课　时教　案讲授　人查幸福课时1.5序　　号2课题内容Pｒoｔein　strｕcture教学时间２００7.09.03教学方法讲授教学课型理论□　实验□习题□实践□复习□其它□教学手段板书、多媒体教学目的1了解氨基酸的基本结构和分类2理解蛋白质一级结构和空间结构3了解蛋白质分析的常用方法和蛋白质组学重点难点氨基酸、蛋白质的结构与功能教学　内　容备　注B1Ａminoaciｄs(氨基酸)L-氨基酸是蛋白质的基本构成单元，它们都有一个共同的结构,a-碳原子上连有一个羧基、一个氨基、一个质子和一个Ｒ侧链,氨基酸结构的差异主要表现为R侧链的区别。a-碳原子是手性碳原子，因此氨基酸具有D-和L－两种立体异构体。组成蛋白质的均为L－氨基酸。根据Ｒ-侧链的极性将氨基酸分类⑴极性带电荷的氨基酸：酸性氨基酸--天冬氨酸、谷氨酸，碱性氨基酸－赖氨酸、精氨酸和组氨酸。⑵极性不带电的氨基酸；⑶非极性氨基酸（参见教材)B2Pｒｏteiｎsｔruｃture　aｎd　ｆunｃtion　(蛋白质结构与功能)大小与形状　蛋白质分为球蛋白和纤维蛋白两类。酶多为球形蛋白,纤维蛋白是重要的结构蛋白,如羊毛和头发中的角蛋白与丝蛋白。一些蛋白质含有非蛋白成分，如酶中的辅基和脂蛋白中的脂类。一级结构氨基酸的a-羧基与下一个氨基酸ａ-氨基缩合形成肽键，许多氨基酸以肽键相连形成的大分子多肽聚合物即为蛋白质。多肽有方向性，游离氨基端为N-端,游离羧基端为C-端。从N－端到C－端的氨基酸顺序即为多肽的一级结构。二级结构　C—N键具有部分双键性质，使得C=O与N=H四原子形成刚性的肽键单元平面，肽键单元间以氢键相连，多肽链在空间折叠形成二级结构,常见的有a－螺旋和β-折叠。三级结构二级结构进一步折叠形成多肽的三级结构。亲水基团位于蛋白质外侧，疏水基团埋在内侧,氢键、盐键、范德华力和疏水力维持结构的稳定。伴娘蛋白帮助蛋白质正确折叠。四级结构由多条多肽链（亚基）构成的寡聚蛋白，稳定三级结构的力量可将亚基维系在一起构成蛋白质的四级结构。如血红蛋白是由两个α球蛋白链和两个β球蛋白链构成的α２β2四聚体。蛋白质的功能（参见教材P2２）结构域和结构基序结构域是同一多肽中有限的高度有序结构片段相连而成。结构基序也称超二级结构,是频繁出现在球蛋白中的二级结构元件群。蛋白质家族不同物种的具有相同功能承担相同生化角色的蛋白质家族成员为直向同源。进化不同但功能相似的蛋白为共生同源。Ｂ3　Protｅin　aｎalysis(蛋白质分析法)蛋白质纯化有根据蛋白质大小进行分离的凝胶过滤层析；离子交换层析、等电聚焦和电泳则是根据蛋白质所带电荷的不同来分离。蛋白质测序用特异的蛋白酶或化学试剂将多肽切割成教小的肽段，然后在自动测序仪中用Ｅdmｅn降解法从N-端开始测序。通过不同酶切割产生的重叠片段的重排再现原始序列。更为简单的方法是对蛋白质的互补ＤNＡ(cDNA)进行测序。测定分子量SDＳ聚丙烯酰胺凝胶电泳和质谱法是最常用的方法。蛋白质组学一个细胞在生存期或任何一个时间内转录表达的全套蛋白称为该细胞的蛋白质组,对这些蛋白质的分裂鉴定和研究即为蛋白质组学。思　考题与　作业完成课后习题(参见教材P315-31６)教学后记与生物化学联系有待加强。课　　时　教案讲授人查幸福课　时1.5序　　号３课题内容Pｒｏpeｒｔｉes　ofnｕcleic　acｉd教学时间2０07.0９.10教学方法讲授教学课型理论□实验□　　习题□实践□复习□　其它□教学手段板书、多媒体教学目的１了解核酸的种类组成和结构２理解ＤNA双螺旋和超螺旋结构　3了解核酸理化性质,尤其是紫外吸收和变性重点难点核酸结构、核酸的理化特性教学内　容备注C1核酸结构核酸是由核糖、碱基（嘌呤和嘧啶）、磷酸构成。碱基与核糖构成核苷，核苷与磷酸形成5/－核苷酸。核酸有两类:⑴DＮA(脱氧核糖核酸）：由脱氧核糖、碱基（A、G、Ｃ、T)、磷酸形成的5/-脱氧核苷酸构成。⑵RNA(核糖核酸）:由核糖、碱基（A、Ｇ、Ｃ、U)、磷酸形成的5’-核苷酸构成。在ＤNＡ和RNＡ分子中，核苷酸之间以3’,５’-磷酸二酯键连接形成长链大分子。核酸分子都有游离的5/端和游离3/端。核酸序列　从左到右按5/端向3/端方向书写核酸的碱基序列,其中的核苷酸用单个碱基字母A、G、C、T或U代表。DNA双螺旋1９５3年沃森和克里克提出⑴两条DNA分子相互缠绕形成右手双螺旋，螺旋有大沟和小沟⑵戊糖-磷酸骨架位于分子外侧,双链间对应碱基靠氢键形成碱基对，其中A与T配对(2个氢键）,G与C配对（3个氢键)。⑶双螺旋的每一匝螺旋含约1０个碱基对。两条链反向平行排列。双螺旋的两条链为互补链，任意一条链的序列可确定另条链的序列，它暗示出DＮA复制和转录的分子机制。A型、B型及Z型螺旋　沃森和克里克提出的为B-DNＡ结构，是适用于所有DNＡ的稳定形式,碱基对与螺旋轴垂直,每匝10bp碱基对,有一条主沟和一条小沟。低温条件下，DＮA可被诱导形成A型螺旋。Ａ型与B型一样均为右手螺旋，但较宽而紧密，碱基对倾斜于螺旋轴,每匝为11个碱基对,A型的主要意义在于它是RNA及ＲＮＡ与DNＡ杂合体的主要形式。在单一交替的嘧啶-嘌呤序列的合成双链DＮＡ中,形成左旋Z－DNＡ，它有Ｚ字型外观,每匝12碱基对,嘌呤核苷酸形成顺式构象。RNＡ二级结构ＲNA通常为单链,可以通过分子内氢键形成局部螺旋结构。C２核酸的理化性质氢键碱基堆积力和疏水作用维持核酸的稳定性。但在强酸条件下，核酸完全水解为碱基、核糖及磷酸,在略稀的酸中则产生脱嘌呤核酸。DＮＡ化学测序法是用化学方法移去特定碱基或将DＮA在特定碱基处断裂。碱性环境中嘌呤产生由酮式向烯醇式转化,导致氢键断裂,双链解离，DNA变性。一些化学物质能使核酸在中性PH下变性,如尿素和甲酰胺。ＤＮA为细长分子，水溶液具有高黏性,机械力或超声波易损伤DＮA，使其黏度下降。将ＤNA放入高浓度高分子盐溶液（如氯化铯）中高速离心，DNＡ最终沉降于与其浮力密度相应的位置,形成狭带，这种技术称为平衡密度梯度离心或等密度梯度离心。DNA的沉降可用来确定其(G+Ｃ)含量和分离具有不同（Ｇ+C)含量的片段。C３核酸的光谱学和热力学性质紫外光吸收和减色性DNＡ和RＮA最大紫外光吸收波长为2６０nm，与蛋白质的２８０nm相区别，用于核酸定性定量和纯化。单核苷酸光吸收值最大,其次是单链DNA(ssＤNA)，双链DNA(dsDNＡ）最小，这种变化称为减色性。DNＡ纯度ｄsDNA的大致纯度可由A26０/A28０的比值来确定，纯dsDNＡ该值为1.8,纯ＲNA为2.0,蛋白质则小于１,如果ＤNA样品的A2６0／Ａ280大于1．8，说明有ＲNA污染,小于１.8，说明含有蛋白质。变性和复性　加热使DNＡ中氢键断裂,双链DNA的螺旋结构变成不规则的线团，称为ＤNＡ变性。变性核酸的紫外光吸收值增大，其变化值一半时对应的温度称为解链温度（Tm)，它随DNＡ中G＋C含量的增加而增大。退火处理(慢速冷却）使得互补链互相配对，恢复双链结构为DNＡ复性。不同核酸链互补部分的复性称为杂交。C４DＮA超螺旋闭环ＤNA　　大多DＮＡ为闭环双链，两条链相互缠绕，缠绕的数目称为连接数（Lk)。分子中没有游离断。超螺旋　超螺旋是DNＡ双链轴线的高度卷曲,如果扭曲方向与双螺旋方向相同,为正超螺旋，反之为负超螺旋。几乎所有细胞中的ＤNA都是负超螺旋。超螺旋的水平可以用连接数的变化（△Ｌｋ)来衡量，如负超螺旋约６圈超螺旋／100圈双螺旋,表示为△Ｌｋ/Ｌk０=-0．0６。拓扑异构体碱基顺序相同但连接数不同的DNA分子称为拓扑异构体。缠绕和扭曲　缠绕(Tw)是指双螺旋一股链绕另一股旋转;扭曲(Ｗr)则是双螺旋轴在空间的盘绕。△Lｋ=△Tw+△Wr（参见教材P47）。嵌入剂如溴化乙锭能插到双螺旋的碱基对中,使之解旋。对负超螺旋分子，(负）扭曲减少,分子构型发生变化。超螺旋有扭转应力，比松散分子具有更高能量,对负超螺旋，这一能量有助于ＤNＡ螺旋的局部解旋。拓扑异构酶　调控DNA超螺旋水平的酶称为拓扑异构酶。有两类:Ⅰ型在DNＡ一股链上产生一个切口，使另一条链得以穿越，连接数每次改变±1;Ⅱ型酶在双链上产生切口,使另一双链DＮＡ片段得以穿过,连接数每次改变±2。对所有的生物体，拓扑异构酶都是一种必要的酶，涉及复制重组和转录。思考题与作　业DNA双螺旋模型的主要内容是什么?教学后记讲超螺旋的时候,采用模型演示讲解效果较好.课　时教　　案讲　授　人查幸福课　时１．5序　号４课题内容Proｋaryｏｔic　andｅukaｒyotｉcｃhromosｏmesｔruｃture教学时间2００7.09.１0教学方法讲授教学课型理论□实验□习题□实践□　复习□　其它□教学手段板书、多媒体教学目的1　理解原核生物和真核生物染色体的结构,掌握真核生物染色体结构特点2理解核小体的组成及组蛋白的类型3　理解异染色质、CpG岛、C0t曲线及基因组复杂度的含义重点难点原核生物的染色体结构、染色质结构、真核生物的染色体结构教学内　容备　注D１原核生物的染色体结构原核生物的基因组可以大肠杆菌染色体为例,其为单一闭环ＤNＡ分子,集中分布在拟核区域内。生长时,ＤＮA持续复制,生长速率最大时，每个细胞平价有基因组的两个拷贝。DNA有50—１００个环或结构域，各个结构域可保持不同水平的超螺旋，整个染色体为负超螺旋。结构域被非特异结合蛋白如HU和H-ＮS等类组蛋白缠绕，使一半超螺旋被束缚。ＲNA聚合酶及mRＮA等有助于类核的组构。尚未发现核小体Ｄ2染色质结构染色质　　真核生物DNA总长度比原核生物大数千倍,并由一定数目分散的染色体组成，每条染色体中的DNA为单一线性分子。染色质是紧密组装高度有序的DNA—蛋白质复合体。　组蛋白是染色质中主要的结合蛋白,分5类：Ｈ２A、H2B、Ｈ3、H4，以及H１。所有组蛋白带有大量正电荷,序列中20％—30％由精氨酸和赖氨酸组成,这样组蛋白与带负电的DNA紧密结合。H1在不同种间在序列上比其他组蛋白具有更多的差异。核小体　是染色质的基本构成单位。长约200ｂp,与由Ｈ2A、H2B、H３、H4各2分子构成的八聚体核心紧密结合有,以及1分子H１松散结合。除去H1,剩下与组蛋白八聚体结合的146ｂp的核小体核心。围绕核小体的DNＡ左手环绕形成负超螺旋(扭曲)。Ｈ１的功能H1与核小体结合，对ＤＮＡ起稳定作用，免受核酸酶的降解。核小体核心与H1构成染色小体。在有些细胞中H1可被极度变异的组蛋白H5所取代。连接DNA核小体间由连接DＮA串联,平均长度为５5ｂp，不同组织中其长度在０—100bp内变化。30nm纤丝　　核小体进一步被组装成高度有序的左手螺旋（螺线管)，即30　ｎm纤丝，每圈螺旋约6个核小体。高级结构　３0nm纤丝构成1０0kb的环，被蛋白和核基质所固定。Ｄ3真核生物染色体结构有丝分裂染色体　呈高度浓缩状态，两个姐妹染色单体在着丝粒处相连，染色体末端是端粒。酵母着丝粒仅由８８bp长的富含AT的序列组成，而哺乳动物的着丝粒序列很长,其侧翼是大量的重复序列,即卫星DNA。端粒是染色体DNA末端特化的序列,由大量的短重复序列构成，由端粒酶合成。间期染色体　　在间期，染色体的基因被转录，ＤＮA被复制，染色体呈松散状态。异染色质　是间期染色体内保持高度浓缩的部分。它大部分由靠近着丝粒的重复卫星DNA构成,无转录活性。雌性哺乳动物的两条X染色体都呈异染色质状态。DNaseⅠ超敏性　DNase　Ⅰ可切割裸露DNA，较长的敏感区域代表着那里正在进行转录，因此染色质对DNaseⅠ的敏感性可被用来定位细胞中具转录活性的染色质。ＣpG甲基化　哺乳动物DNA中５／—CG—３/序列通常在胞嘧啶碱基处被甲基化，它与染色质中的非转录区相连。基因组中还有未甲基化的CpG“岛”，包围着持家基因的启动子区域，形成DNａseⅠ敏感区。组蛋白变异体和修饰　被包装的染色质的快速变化可通过组蛋白的化学修饰来调控,如核心组蛋白N端赖氨酸残基的乙酰化；而有丝分裂中染色体的浓缩伴随着组蛋白H１的磷酸化。D４　基因组复杂度非编码DＮA　复杂的真核生物基因组DNA是原核生物的1０00多倍,但大部分不编码蛋白质,其编码区被内含子中断。这些非编码ＤNＡ大部分由多重拷贝组成,这些拷贝可以是串联重复的(如卫星DＮA）或是分散于基因组中(如分散的Alｕ元件)。复性动力学DNA加热变性后在低浓度下复性，在一定时间内（t)，ＤNA复性的比例由初始DNA浓度(C0)决定的。用剩余单链DNA的比例（f)对C0t作图,得到的曲线代表了DNＡ样品的复性动力学，即Ｃ0　t曲线。多个拷贝的单链片段比单一序列的复性快。DNA复性速率可用光谱法（紫外吸收值降低）和羟基磷灰石层析法测量。人类DＮA复性分３个阶段：高度重复》中度重复)单一序列。E.cｏli的复性仅有一个阶段。单一序列ＤNA　在单倍体基因组中只有一个或几个拷贝的序列。在E.cｏli基因组中,所有DNA都是单一序列,但由于DNA较短,其复性较快,C0t值相对较小。串联基因簇由串联重复的基因或基因簇构成中度重复DＮA区段。如ｒＲＮＡ基因和组蛋白基因簇,1８Ｓ、５.8S　、28SｒRNＡ基因及间隔区组成的单位在DNA链上串联重复约5000次,这些基因位于核仁区。5个组蛋白基因同在一个基因簇，串联重复达数百次。分散重复DNA　　中度重复DNA大部分由短散布元件(ＳINES,有几百个碱基)和长散布元件（LＩNEＳ有几千个碱基)重复上千次构成，并分散于基因组中。如Alu元件和L1元件，它们几乎占了人类基因组的１0%　。卫星DNＡ　由极短的序列高度重复串联排列而成,在CｓCl密度梯度离心中,在主带ＤＮA附近出现的卫星带。卫星DNＡ又分小卫星DNA（不确定数目串联重复,VNTR)和微卫星ＤNＡ（简单串联重复，STR)，前者出现在染色体末端,后者则平均分布在染色体上。鉴定亲缘关系的DNA指纹技术的基础就是小卫星DNA的重复排列。基因多态性　基因或基因座上碱基变化能使该基因座产生多种形式。思　考题与作业什么是卫星DNA.?教学后记在复性动力学部分要讲更易懂些.课　　时　教　　案讲授　人查幸福课　时３序号５课题内容ＤＮＡ　repliｃatｉoｎ教学时间２００7.09.21教学方法讲授教学课型理论□实验□　习题□实践□　复习□其它□教学手段板书、多媒体教学目的1　理解DNA复制的半保留机制和半不连续复制2　掌握细菌DNＡ复制过程及有重要作用的酶和蛋白质3了解细胞周期4了解真核生物ＤNA复制的特点重点难点原核和真核生物的复制机制教　学　内容备注E1　DＮＡ复制概述半保留机制DＮA两条亲代链分别作为模板催化新生子链的合成，新生DNA的一条链是原来的旧链，另一条是新合成的，为半保留复制。Mｅsｅlsｏn和Ｓtahl(1９58年)用实验证明了该机制（见教材Ｐ71）。亲代链分开及新生DNA开始复制处称为复制叉。DNA合成的底物是脱氧核苷三磷酸(dNTP　):dＡTPdＧTＰ、dCＴP、　　ｄTTP　　。合成的能量来自　dNＴP的水解。复制子、复制起始与终点　　以单一单位复制的任一段DＮA都称为复制子。每个复制子都有固定的起始点，原核生物许多病毒的DNA　呈环形，为单一复制子，通常两个复制叉从一个起始点向两个方向复制，复制的起始和细胞生长周期调节都在起始点处调节。真核生物的线性染色体由多复制子构成，每个复制子都有自己的起始点,起始点在最初解链处富含AT序列,它比富含GC的起始点更易解链。半不连续复制　　由于DＮA新链合成只允许以5/→3／　方向进行,而两条亲本链反向平行,因而一条新链从起始点按5/→3/　　方向连续合成（前导链）,另一条新链（后随链）从复制叉开始按　5/→3／方向先合成一些短的ＤＮＡ片段(冈崎片段)，再由连接酶连成一条连续的DNA。即前导链连续合成为长链,后随链则是间断合成的,这种合成方式为半不连续复制。RNA引导　在每一片段的5/端先合成一小段RNA(引物），引导DNA合成。E２　细菌的DＮＡ复制起始Ｅ．coli的起始点位于遗传基因座ｏrｉC,大肠杆菌编码的蛋白DnａA首先识别和结合于orｉC的9bp重复序列形成复合物，约4５ｂp成为单链，DnａB进入,它是DNA解旋酶,利用ＡTP水解产生的能量解开双链ＤNA，形成的单链泡被单链结合蛋白Ｓsb所覆盖。ＤNA引发酶结合到DＮＡ上并合成引物RNA。解旋　　DNA解旋酶沿模板链前进,打开双螺旋使复制顺利进行,在闭环DNA中复制叉处解旋所形成的正超螺旋可通过Ⅱ型拓扑异构酶即DNA旋转酶的作用而释放。延伸DNA聚合酶Ⅲ的全酶二聚体引发体和DＮA解旋酶结合成复合体(复制体),以每秒９00ｂp的速率合成ＤNA。引发体含有ＤｎaB解旋酶和DNA引物酶,在后续链上间断合成RＮA引物。DNA聚合酶Ⅲ催化合成DNA,该酶含有聚合酶α亚基和一个3/→5/外切核酸酶ε亚基。DNＡ聚合酶Ⅰ负责切除引物并填补缺口,该酶具有5／→　　3/聚合酶、５/→３/外切核酸酶及3/→5/校正外切核酸酶活性。DNA连接酶填补片段间的缺口。终止与分离　两个复制叉在oriＣ约１800的对面相遇。该区域有终止子位点，它们与DｎaB抑制剂（tuｓ基因的产物)结合，阻止复制叉移动。复制结束后两个相扣的子链ＤＮＡ由拓扑异构酶Ⅳ(一种Ⅱ型拓扑异构酶)解联，分配到两个子细胞。Ｅ3　细胞周期细胞周期　细胞分裂为两个子细胞的全部过程为细胞周期,它包括ＤＮＡ的复制和细胞分裂。细胞周期分4个时期：G１期—细胞为复制作准备；Ｓ期—DＮA复制；G2期—S期后有丝分裂前的短暂期；有丝分裂期—染色体对等分配到两个子细胞,它又有前、中、后期之分。G１　、S、Ｇ2共同组成间期。有丝分裂后，增殖的细胞进入下一个细胞周期的G1期，也可脱离细胞周期进入非增殖的休眠状态G0期(沉默期）。检验点及其调控　在Ｇ１期有决定细胞进入下一个分裂周期的限制点（R点)，细胞分裂周期起始还需促细胞分裂原,若细胞在到达Ｒ点之前缺乏促细胞分裂原，细胞将重进G０期。细胞周期中终止细胞分裂的那些点叫检验点,它在间歇期发生以保证细胞分裂之前完成DNA复制。细胞周期蛋白和CDK蛋白磷酸化是调控细胞周期进程的一个主要机制，由一个调节亚基(细胞周期蛋白）和依赖细胞周期蛋白的激酶(CＤK）来完成,细胞周期蛋白—CDK复合物决定将被磷酸化的目标蛋白。E２F和RＢ的调控　由G１期进入S期主要依靠对Ｅ2F这一转录因子的激活,Ｅ2Ｆ的活性又受与其结合的蛋白ＲB的抑制，在G1中后期，细胞周期蛋白—CDK复合物使ＲB磷酸化从而释放Ｅ2F进而激活转录。细胞周期的激活、抑制和癌症　小的抑制蛋白如CIP蛋白和INK４蛋白可通过抑制细胞周期蛋白—CDK复合物的活性来延迟细胞周期的进程。细胞周期与癌症间有着根本的联系，G1到S期的过渡受到原癌基因和抑癌蛋白的调控。B细胞的癌变与细胞周期蛋白D1基因的过表达相关。人类癌症中两个重要的抑癌基因产物—抑癌蛋白ＲＢ和P5３均与细胞周期调控密切相关,ＲB调控E２F的活性，当DNA损伤时，P５３诱导P21WAＦ１/CIP１的合成。E4　真核生物的DNA复制实验系统　仅有400个复制子的酵母,更为简单的猿猴病毒（ＳV40）病毒都是很好的模型。非洲爪蟾卵提取物广泛用于外加DＮA或整个细胞核的复制。起始点和起始约２0—５0个复制子串联成簇在S期同时开始复制，常染色质先复制,其次为异染色质,最后是着丝粒和端粒。酵母的起始点都有一个1１bｐ长的保守序列（自动复制序列ARＳ)，它可结合起始点识别复合体(ORＣ),被CDK激活后引导DNA复制。每个复制子仅起始一次,特许因子在作用后失活能防止复制的再次起始。复制叉真核生物复制叉移动速度为每秒５0bp,该过程需要解旋酶、单链结合蛋白（复制蛋白A)和3种DNA聚合酶。聚合酶α引发复制的起始,聚合酶δ延伸前导链，聚合酶ε完成后续链的复制。DNＡ及复制所需的蛋白质均固定在核基质上。端粒的复制　　真核染色体末端(端粒）由多个简单重复序列构成，不带遗传信息，且３／端突出于5/端　以防止半不连续复制不能复制线性染色体末端而造成遗传信息的丢失。端粒酶负责端粒ＤNA的复制，它带有与端粒重复序列互补的RＮA分子。该酶在体细胞中处于抑制状态,但在许多癌细胞中处于激活状态。思考题与作业什么是半保留机制，　什么是半不连续复制,　复制的主要过程有哪些？教学后记这个部分是分子生物学的重要章节,要讲仔细.课　时　　教　案讲　授人查幸福课　时3序　号６课题内容ＤNAdａmａge，repairandrｅｃoｍbination教学时间2007.09.28教学方法讲授教学课型理论□　实验□习题□实践□复习□其它□教学手段板书、多媒体教学目的1　了解突变的种类和产生的因素2　理解DNA复制忠实性的机制３掌握ＤＮA修复的机制4　掌握DNA重组的方式及原理重点难点DNA突变、修复、重组教学内　容备　注F1诱变突变　指ＤNA碱基序列发生的永久的可遗传的改变。一个单一碱基的改变为点突变,它包括转换(嘌呤与嘌呤,嘧啶与嘧啶间的互换)或颠换(嘌呤与嘧啶间的互换）。如果点突变发生在ＤNA的非编码区、非调节区或密码子的第3个碱基，它不会影响渗入蛋白质中的氨基酸,为沉默突变；如果发生氨基酸的改变,则为错义突变。形成新的终止密码的突变为无义突变,产生截短的蛋白质产物。一个或多个碱基的增加或丢失,会引起移码突变。群体中许多沉默突变及非致死性突变的积累会产生遗传多态性。复制忠实性复制的精确性有3种机制：互补碱基配对原则(模板链和进入核苷酸在DNＡ聚合酶的作用位点正确配对）;聚合酶的３/→5/外切酶活性有校对功能，它能回走从3／端切掉错配核苷酸,引物是DＮA聚合酶发挥自我校正功能的必要条件；逃脱校对的错误可被错配修复机制所纠正。诱变剂常见的物理诱变剂为紫外线,它引起相邻嘧啶核苷酸产生嘧啶二聚体。化学诱变剂种类很多,碱基类似物可改变碱基配对特性，诱发直接突变(如5—溴尿嘧啶是胸腺嘧啶的类似物）。亚硝酸使胞嘧啶脱氨变成尿嘧啶，引起复制中A—T向G—C转化。烷化剂能在DNA不同位置加上烷基，造成碱基脱落,经修复才能防止ＤNA损伤,细胞对损伤的处理有可能会由于间接诱变而导致突变。直接诱变和间接诱变　DNA中存在稳定的、配对特性发生改变的碱基而导致的突变为直接诱变；在有些情况下，一些损伤DNA聚合酶为了保证染色体的完整性在损伤对应的位点上插入错误的碱基,导致间接诱变;突变发生在损伤的位点上为定点突变,发生在其它位点为非定点突变。原核生物中转移损伤ＤNA合成属于对DNA损伤的ＳOS反应（有时也叫“易错修复”）Ｆ２　DNA损伤碱基的损伤和丢失　ＤＮA的一些损伤是自发的，如胞嘧啶会自发水解脱氨变为尿嘧啶,它会在接下来的复制中与腺嘌呤配对。生理温度下，哺乳动物的基因组每天约失去10000嘌呤和几百个嘧啶。许多已改变的碱基会被专一性的ＤNA糖基化酶所除去，形成无嘌呤和无嘧啶位点或AP位点。氧化性损伤自由基可攻击DNA，产生氧化产物造成氧化损伤烷基化烷化剂为亲电化学试剂，可将烷基加到核酸的各种位点,导致DNA损伤。有些是致死性的,多数导致间接诱变损伤。聚化加合物紫外线使相邻嘧啶，尤其是胸腺嘧啶形成环丁烷嘧啶二聚体;煤焦油中的苯并芘在肝脏产生的一种产物可与鸟嘌呤残基共价结合;芳香族烷化剂、黄曲霉毒素B１均可与DNＡ共价结合。F3　ＤNA修复光复活　DNA中的嘧啶二聚体可通过可见光的光解作用而恢复为单体,催化此过程的酶是DNA光解酶(光复活酶）。Ｅ．coｌi的光解酶有两个发色团：蝶呤和FAD。这是一种无差错的“直接修复”。烷基转移酶　该酶可直接从突变的O6—烷基鸟嘌呤上除去烷基，酶作用后即失活。它也属于无差错直接修复。切除修复　为普遍的无差错的修复机制。有两种形式：核苷酸切除修复(如E.coli中的UvrAＢＣ内切核酸酶识别并切除嘧啶二聚体和其他大块损伤，缺口可由DNＡ聚合酶Ⅰ和连接酶填补)；碱基切除修复（专一的DNA糖基化酶识别修饰碱基,切除修饰碱基与糖基间的Ｎ—糖苷键，留下一个脱嘌呤或脱嘧啶的AＰ位点,ＡP内切核酸酶在该位点切开DＮA。错配修复是一种特殊的切除修复，它是按模板的遗传信息来修复错配碱基的,因此修复时首先要区别模板链和新合成的DNA链。它通过碱基的甲基化来实现的。大肠杆菌DＮA的5／—ＧＡTＣ序列中Ａ的Ｎ6都是甲基化的（Dam甲基化酶负责）,复制后的一个短暂时间内，新合成链的GＡTC中的Ａ未被甲基化,故子代ＤNＡ暂时是半甲基化的,这是识别的基础。错配的碱基被MｕtS和MutL组合的复合体识别并与之结合，再与MutH内切核酸酶结合，后者在子代链GＡTＣ附近的位点上产生缺刻，启动对损伤区的切除修复。遗传性非息肉结肠癌就是一种错配修复酶突变丢失引起的。着色性干皮病（ＸＰ)患者缺乏对紫外线引起的大块DNＡ损伤的切除功能，对阳光极度敏感,易患皮肤癌F4　　重组同源重组也称一般重组,即两个双螺旋DNＡ分子间同源序列进行交换。双倍体真核生物发生在减数分裂过程,非姐妹染色单体交换相对应的区域,产生的单倍体配子会包含父母本两方的遗传信息。单倍体细菌也可重组，如发生在部分已复制DNA间或染色体DNA与外源DNA(质粒或噬菌体）间。重组的过程和机制包括断裂—复合、异源双链、分支迁移、Ｈolｌｉday结构、拆分(见教材P９8图）。大肠杆菌的核酸酶和ＲeｃＢＣD结合在cｈi序列上并产生切口形成单链末端，单链DNA被ＲecA蛋白包裹,4条单链形成Ｈｏlliday结构。同源重组对DNＡ修复也很重要（复制后修复或重组修复)。位点特异性重组　非同源DNＡ的特异片段间的交换,它是在结合序列部位由特异的酶来催化断裂重接,而同源重组则是由能与RｅcA蛋白结合的DNA序列随机断裂引发的。λ噬菌体可将自身基因组插入大肠杆菌染色体的特定位点，噬菌体编码的整合酶与细菌编码的整合宿主因子(IHF）促成重组结果和λＤNＡ进入宿主染色体。λ噬菌体编码的切除酶被激活时,整合作用发生逆转,λ—DNＡ脱离细菌基因组。在真核生物中,免疫球蛋白有３个基因段编码重链和轻链的可变区:V、Ｄ和J。这些基因段间的重组产生大量的不同重链和轻链基因序列，导致抗体种类的多样化。转座作用　　又称非常重组,一些短的DNA片段（转座子或转座元件）可转移进基因组的几乎任何位置。转座子均有两个结构特征：两端有2０～4０ｂp的反向重复序列；具有编码转座酶的基因,该酶催化转座子插入新的位置。E.coli中的ＩS元件(插入序列)是最为简单的转座子。Ｔn转座子系列除了转座酶，还携带其它基因（如抗性基因),其中的β—内酰胺酶可使生物体抗青霉素。酵母中的Tｙ元件编码的蛋白与反转录病毒的反转录酶和整合酶相似,Ty元件两侧为长末端重复序列,它先转录成ＲＮA再反转录到DNA双螺旋中,然后插入到其它地方,果蝇的copia转座子与其相似，称为反转录转座子。高等真核生物中的一些分散重复序列（如LＩNEＳ和SIＮES)很可能是通过转座作用在基因组内传播的。思考题与作业DNA修复有哪些类型?机制各是什么?教学后记ＤNＡ修复机理用模型来讲解会清楚一些。课　时　教案讲　授人查幸福课　时3序　　号7课题内容Geneｍanipulatiｏn教学时间２０07.１0.05教学方法讲授教学课型理论□实验□　习题□实践□　复习□　其它□教学手段板书、多媒体教学目的1　了解DＮA克隆及常用宿主和载体２　掌握基因组文库和cDNA文库3　掌握DNA克隆的一般步骤重点难点DNA克隆策略及其基本方法教　学　内　容备　注G1　DNA克隆概述DNＡ克隆将生物体基因组DＮA片段作为自主复制载体的一部分进行独立复制,对其进行分离和操作即为DNＡ克隆。基因组的较小片段连接到一段可以自主复制的DNＡ（载体)上,形成重组DNＡ，带有重组DNA的宿主细胞增殖构成一群具有遗传一致性的个体为单克隆。宿主和载体　载体应具有整合特性、独立复制特性和易被筛选的选择标志,常用的载体有细菌质粒、噬菌体(λ噬菌体和噬菌体M1３）和一些病毒，还有人工改造的载体如黏粒、细菌人工染色体、酵母人工染色体等。常用宿主有大肠杆菌和酵母菌。亚克隆　将已克隆的DNA片段从一载体向另一载体转移的过程为亚克隆。它可用来对较大的克隆片段上的较短区段进行仔细研究。DNＡ文库是一套ＤＮＡ克隆，它是带有不同ＤNA片段的载体在宿主中扩增后的产物。由基因组DNA构建的为基因组文库,由细胞ｍＲＮA经反转录合成的ｃDNA插入载体构成cDＮＡ文库。筛选含有目的基因的克隆通常用ＤNA探针经杂交来测出，并用限制性酶切图谱来分析DＮＡ片段。Ｇ2质粒DNA的制备质粒载体　大肠杆菌的质粒是染色体外的环状DNA,有复制起点(oｒi)，能独立复制,含有抗生素抗性基因(bｌａ　或ampr基因—抗青霉素，tetA基因—抗四环素)。是常用的载体。质粒的制备碱裂解法最常用：菌体沉淀悬浮于缓冲液中，加入含有SDS的氢氧化钠溶液使ＤNA变性RNＡ水解，再用高浓度pＨ５的乙酸钾沉淀变性蛋白质和染色体DＮA,离心,上清中含质粒DNＡ。用酚抽提法除去残余蛋白,留在水相中的ＤNＡ和RNＡ可由乙醇沉淀得浓缩并用核糖核酸酶A降解残余RNA。也可用氯化铯密度梯度离心纯化，这是获的极纯的超螺旋质粒DNA的最佳方法。G３限制酶与电泳限制性内切核酸酶　细菌含有限制修饰系统，有两个主要组分：限制性内切核酸酶（识别一小段对称的DNA序列,在识别位点处切割）和甲基化酶（对细胞ＤNA识别序列内的Ｃ或A加上一个甲基，保护宿主细胞ＤNA不被内切酶降解）识别序列限制性内切核酸酶仅识别6bp的回文序列，在该位点酶切DNA形成两个片段,每个片段有５/突出末端（带磷酸基团)和带游离羟基的3/端。黏末端　限制性酶解反应产物的突出末端被称为黏末端,它可与其它任何具有相同突出序列的末端结合。酶解切割的DNA片段可用溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶电泳来分离。G4　连接、转化、与重组体分析DNＡ连接　来自Ｔ4噬菌体的连接酶可将目的基因与载体的黏性末端退火碱基断裂的磷酸二酯键闭合。重组DNA分子　目的基因插入载体DNＡ的酶切位点处形成的环状分子为重组ＤNA分子。转化　重组体进入宿主(大肠杆菌）一般采用转化方式,用Ｃa２+　处理大肠杆菌,细胞易吸收外源DNA，这一过程为转化，预处理的细胞被称为感受态细胞筛选　感受态细胞在琼脂平板上生长出的克隆大多不含质粒,要对含质粒的克隆进行筛选，通常利用质粒含有的抗性基因来筛选。筛选的转化子进行增殖保存和分析。思考题与作业ＤNA克隆的主要过程有哪些?如何鉴定阳性克隆?教学后记讲一些ＤNA克隆的实例更能帮助学生理解课时　教　案讲授人查幸福课　　时３序号8课题内容Clｏnｉngvｅctoｒ教学时间20０７.10.1２教学方法讲授教学课型理论□实验□　习题□实践□　　复习□其它□教学手段板书、多媒体教学目的了解和熟悉常用的适用于各种用途的克隆载体重点难点质粒载体的设计、噬菌体载体教　学内容备　注H1Dｅｓｉｇn　ofpｌaｓmidvectｏrs(质粒载体的设计)克隆过程中最重要的步骤之一就是鉴别环化载体分子与重组质粒，已形成了许多方便于鉴定的方法。当载体分子上具有双抗生素抗性基因时，就可以用插入片段插入某个抗性基因而使其失活的方式来筛选重组体。质粒上的laｃZ’基因的插入失活被用来在含有IPTＧ和X-gal的平板上筛选重组体。多克隆位点即具有多个限制酶酶切位点的一段DNA序列,为选择限制酶或克隆中所使用的酶提供更多的选择性。许多载体被设计成使插入片段内的基因可从强启动子起始转录并表达。如用Ｔ7表达载体。Ｈ2Baｃtｅriophａgｅ　vectors噬菌体对大肠杆菌的侵染以及随后的细胞裂解过程可用来扩增克隆的ＤＮA片段。将目的DNＡ片段连接于侵染所必须的基因的末端,形成重组噬菌体DNA。经过包装与侵染,最后噬菌体斑形成。M13噬菌体在大肠杆菌细胞内以双链环状形式复制，可以像质粒一样操作，但产生的噬菌体颗粒内仅含有环状sｓDNA。H3Cosmiｄs,　YACsａndＢACs真核生物基因和基因组结构的分析需要比质粒和噬菌体更能容纳大片段DＮA载体。经常使用的有黏粒载体、酵母人工染色体和细菌人工染色体等。H4Ｅukaｒyｏtiｃvectorｓ许多基因克隆的应用都需要将基因转入真核细胞并获得表达。转染真核细胞可以采用电穿孔、微注射和固体粒子轰击。经常使用的载体有穿梭载体、酵母附加型质粒、根癌农杆菌Ti质粒、杆状病毒和哺乳动物病毒载体等。思考题与作业常用的载体有哪几类？性质、插入片段大小等如何？表达载体与克隆载体的有哪些不同？教学后记学生反应内容较抽象。课　时　教　案讲授　人查幸福课　　时3序号9课题内容Gｅnelibｒariｅsandｓｃreenｉng教学时间20０7.10.19教学方法讲授教学课型理论□实验□习题□实践□　复习□其它□教学手段板书、多媒体教学目的1了解基因文库的种类及区别２掌握基因文库基本的制作方法重点难点基因组文库、ｃＤNA文库制作教　学内　容备注Ｉ1基因组文库基因文库　　某生物不同DＮA序列的总集构成基因文库，它包括基因组文库和cＤNA文库,基因组文库的DＮA来自基因组,由细胞ｍRNA经反转录形成的互补DNA(cDNA）构成的为ｃDNＡ文库。ｃDNＡ文库不包括不能转录的核基因序列文库大小计算公式见P140基因组DNA纯化的基因组DＮＡ需要用物理剪切或限制性酶解切割成载体适用的片段(15～25Kb或更大）。常用的酶是Saｕ3A，该酶产生的酶切黏性末端与BａmHI酶解载体产生的末端相同载体较小的生物如大肠杆菌可用质粒载体构建基因组文库;较大的生物用λ—噬菌体、黏粒、细菌人工染色体(BAC）或酵母人工染色体(YＡC)，它们依次容纳23、４5、3５０、1000kb的插入片段Ｉ2　ｃDNA文库mRNA分离和纯化　主要用于真核生物。用结合有寡聚(dＴ)的磁珠加到细胞裂解液，在用强磁铁吸出磁珠并洗出mRNA。再用无细胞翻译系统（如麦胚抽提液或兔网织红细胞裂解液）来检测mRNA的完整性，也可用凝胶电泳直接检测，用杂交法分离mRNA。ｃＤＮA的合成用反转录酶通过向引物（一般为寡聚dT）的3／　末端添加dNTP来合成　cDNA的第一条链。用末端转移酶对cDNA的第一条链的3/　末端加尾很容易合成全长的第二链。也可用反转录酶或Ｋlenoｗ酶延伸引物来合成第二链cDＮＡ末端的处理　先用单链特异性核酸酶切掉凸出的３／端,再用Klｅnow酶补平后加上接头。为避免限制性内切核酸酶切割cDNA内部，在添加接头前先用EcoRⅠ甲基化酶甲基化。最后用T4DＮA连接酶连接。与载体的连接　载体先用碱性磷酸酶去磷酸化以防止载体自连接,Ｔ4DＮＡ连接酶连接载体与cDNA。噬菌体λgt1１是构建表达文库的最适载体I3筛选流程筛选用核酸探针杂交。制作探针的方法常用聚合酶链反应（ＰＣＲ)制成PCR探针。将菌落或噬菌斑转移到膜上，将其置入含放射性标志探针溶液中保温，检出相应克隆。表达筛选　　通过抗体筛选来检测cDNA编码的蛋白质杂交扣留和释放ｃＤＮA与ｍRNA杂交后可抑制某些mRＮA的翻译（杂交扣留翻译)。杂交的mRＮA被纯化后进行翻译（杂交释放翻译）可鉴定cDNA克隆编码的蛋白染色体步移　从文库中分离相邻基因组的克隆来克隆目的基因为染色体步移。思考题与作业什么是基因组文库？主要流程有哪些步骤?教学后记文库的构建是本节课的中心内容。课　　时　教　案讲　授人查幸福课　时3序　号１0课题内容Analysisandｕses　ofcｌonedＤNA教学时间2０07.１0.26教学方法讲授教学课型理论□实验□　习题□实践□　复习□　　其它□教学手段板书、多媒体教学目的1了解核酸测序的基本方法2了解限制图谱，序列分析,基因组测序计划３理解PCR反应的原理及操作4　掌握克隆技术的应用重点难点克隆的鉴定、核酸测序、聚合酶链式反应教学内容备　注J1克隆的鉴定(一般了解）J2核酸测序ＤＮA　测序有Maxam和Giｌｂｅrt的化学法及Sanger的酶学法ＲNＡ测序　　　用能切割3/端特异核苷酸的RNase来酶解具5／端标记的ＲＮA进行序列测定。测定的DＮA或RNA序列均输入序列数据库（如EＭＢＬ和Ｇｅnbａｎk）,还要用计算机对序列进行分析检索，找出其特征。基因组测序计划测定某种生物基因组的全部序列。如人类基因组测序基本完成。大部分人类基因组测序使用的是BAC克隆。Ｊ3聚合酶链式反应PＣR　利用与DNＡ模板两端互补的一对引物来扩增一段DNA的过程为聚合酶链反应（PCR）PCＲ循环目的DNA加热至95０Ｃ变性分为两条链,当降温至5５0C，引物与模板退火,再升温至720C进行聚合反应（消耗ｄNTP　和Mg2+），对目标分子不断拷贝,直至温度再次升到９５0Ｃ，变性、退火、聚合不断循环,使分子数目迅速增长。通常循环20~40次已知一些序列信息从而能设计出引物的ＤＮA都能应用于ＰCR。引物通常为18~30个核苷酸，如果克隆一个只知道部分氨基酸序列的蛋白质的cDNA，可利用遗传密码的简并性设计简并引物，这种应用简并寡核苷酸引物的PCR有时也叫ＤＯＰ—ＰCＲ；从嗜热菌中分离的热稳定的ＤNA聚合酶被用于PCR,常用Tａq聚合酶。PCＲ还有一些派生技术。J4　克隆基因的组构以寡聚dＴ为引物合成的cDNA通常在3/端有poly(A)标志来推导出编码区。基因组克隆中基因的存在和极性不明显,可通过作图和杂交实验来确定J５克隆基因的诱变缺失诱变从一端逐渐删除DNA以确定特定序列的特性为缺失诱变。对于ｃDＮA克隆通常从编码区一端删除，产生Ｎ端或C端截短的蛋白；基因组克隆逐步删除起始点上游的序列以发现具有启动子和调控功能的最短上游序列。外切核酸酶Ⅲ可从凹进的3/端沿3/至5/方向移去一条链形成单向缺失,再用S1或绿豆核酸酶除去突出部分形成平末端进行连接，经转化产生缺失的克隆。定点诱变改变序列中特定核苷酸的诱变PCR诱变J6克隆技术的应用包括重组蛋白的生产、遗传修饰生物体的构建、DNA指纹分析、诊断试剂盒及基因治疗思　考题与作业什么是ＰCR？如何鉴定阳性克隆？教学后记PCR在日常生活中的应用更能表明分子生物学对我们的深刻影响。课时　教案讲授人何宁佳课时3序　　号11课题内容Transｃｒｉptionin　ｐｒokaｒyｏtes教学时间2０07．１１．0２教学方法讲授教学课型理论□　实验□习题□实践□　复习□其它□教学手段板书、多媒体教学目的1　掌握原核生物RNＡ聚合酶的结构。2理解大肠杆菌σ因子尤其是σ70的功能和识别序列。3　详细介绍原核生物转录起始、延伸和终止三大过程以及所涉及到的重要分子的作用机制。重点难点大肠杆菌RNＡ聚合酶的结构;ｍRNA　合成时的方向和正反义链的区分、大肠杆菌σ７0启动子，及其启动效率的理解；以及原核生物RNA合成过程。教　学内容备　注K１Baｓｉｃ　princiｐｌeｓof　transcrｉptiｏn(转录的基本原则)转录概述　　以DNA为模板合成RNA的过程为转录,它由ＲNA聚合酶催化AＴP、GＴP、UTP、ＣTP4种原料沿5’→3’方向合成。ＤNA上通常只有一条链会转录成RＮA，为有义链；另一条链为反义链,也叫模板链。起始RＮＡ聚合酶结合在双链DNA的启动子部位，该部位双螺旋解旋，聚合酶从起始位点起始RNA的合成，该位点被定义为基因序列的+1位置。延伸　聚合酶沿５’→３’方向延伸RＮA链。终止发生在终止子处,该序列含有自身互补区，能在ＲＮＡ产物上形成茎环或发夹结构从而终止转录。K2EｓcheriｃhiａcoliＲNApolｙmｅrases(大肠杆菌RNＡ聚合酶)大肠杆菌RNA聚合酶　有5个亚基组成:α、β、β’、ω、σ亚基；全酶包括α2ββ’ωσ,转录开始后σ因子从转录复合物上释放下来，剩下的酶（核心酶）沿DＮA链移动。α亚基无转录功能,但对核心酶的组装是必需的,β亚基是酶的催化中心，受利福平抑制。β’亚基结合了两个Zn２+，可能负责酶与模板的结合,肝素能与该亚基结合，σ因子以δ7０最常见，在识别启动子中起关键作用，对转录延伸不重要。K3ＴheＥ.coliσ7０pｒｏｍotｅｒ　(大肠杆菌σ７0启动子)　由４0~６0bp序列组成，－５5—+２0的区域被聚合酶结合，在-１0和-35位置的两个６bp序列尤为重要－10序列是位于转录起始位点-１０位置的保守序列（共有序列为TAＴAAＴ),又称Pｒｉbnow框，可能与解旋有关。在-３5位置还有一段保守序列（共有序列为TＴGAＣＡ),与σ因子组成识别区。起始点90%的基因转录起始点是嘌呤，G比A更重要。影响启动子的效率的因素包括-35、-1０区域，起始位点附近的序列等。Ｋ４　Tｒａnscription,iｎｉtiａｔion,elonｇatiｏｎａnd　teｒminａtｉon(转录的起始延伸和终止)σ因子促使全酶结合到正确的启动子位点，并识别-3５和－10序列,聚合酶与启动子DNA形成闭合复合物;DNA初始解旋并与聚合酶形成开放复合物；无需引物，聚合酶不移动从ＧＴP或AＴP开始合成最初的9个核苷酸；起始成功后，聚合酶释放σ因子，形成聚合酶-DNＡ－新生RNA聚合体,使聚合酶沿ＤNA链移动；当出现终止信号(常见的是带有一个茎和一个环的RNA发夹结构),茎富含G－C,发夹后跟一串U残基,与模版上的A配对,导致RＮA和反义链的弱结合,利于ＲＮＡ与模板的解离。有